2017 Fiscal Year Research-status Report
Development of method for identifying immune competrent pigs and validation of the efficacy in commercial pig population
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17K08057
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| Research Institution | National Agriculture and Food Research Organization |
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Principal Investigator |
新開 浩樹 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, 任期付研究員 (30502687)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
上西 博英 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, ユニット長 (80391556)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ブタ / 感染症 / 抗病性 / 免疫 / 選抜 / 育種 / 遺伝子多型 / プロモーター |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は、平成26～27年度に実施した科研費研究課題「ブタの免疫能選抜がもたらした遺伝的特性変化の解明」において、免疫能選抜（白血球貪食能、補体代替経路活性、豚丹毒ワクチン接種後の抗体応答の育種価を指標）により造成された高免疫豚由来のマクロファージにおいて、病原体由来リガンド刺激後に特徴的な発現変化を示す5個の免疫関連遺伝子（RNASEL、SAMHD1、STAT3、TMEM150C、TRIM21）とその発現を制御する可能性のある多型を含む約5kbのプロモーター型を同定している。
本研究では、これらのプロモーター型を構成する多型のうち、発現変化の原因となる多型を同定して「高免疫豚マーカー」の開発を行い、国内豚商用集団における簡便な高免疫豚選抜の可能性を検討する予定である。
今年度は、上記5個の免疫関連遺伝子について、それぞれ高免疫豚型および無選抜の基礎豚型のプロモーター配列全長（約5kb）をルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流に挿入した発現ベクターを作製し、THP-1細胞に遺伝子導入してリガンド刺激後の発現への影響をレポーターアッセイにより調べたところ、STAT3およびTRIM21の2個の遺伝子において、前科研費課題で得られた結果と同様の発現パターンを示した。この2個の遺伝子について、発現変化の原因となる多型を同定するために、プロモーター領域の約600～800bpの部分的断片をルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流に挿入した多数の発現ベクターを作製し、THP-1細胞を用いたレポーターアッセイの条件検討を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
今年度は、STAT3およびTRIM21遺伝子において、リガンド刺激後の発現変化の原因であるプロモーター多型（一塩基多型もしくは挿入/欠失）を同定し、ゲノムDNAを用いて当該多型の有無の簡便な検出法（Allele Specific PCR法等）の開発まで行う予定であったが、そこまでは到達出来なかった。その理由として、2回目のレポーターアッセイ時に、THP-1細胞の培養が上手くいかなかったことが考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
STAT3およびTRIM21遺伝子における、リガンド刺激後の発現変化の原因であるプロモーター多型の同定に関しては、THP-1細胞以外にも当研究室で開発した、不死化ブタ腎臓由来マクロファージ等も使用して引き続き行う予定である。
また、6世代に渡る免疫能選抜の過程における、実験豚のゲノムDNAや白血球貪食能、補体代替経路活性、豚丹毒ワクチン接種後の抗体応答の形質値のデータも保存しており、例えば3世代目では基礎豚および高免疫豚型のプロモーターの頻度が、いずれにも固定されていないことが想定される。従って、3世代目の実験豚を用いて、5個の免疫関連遺伝子のプロモーターの遺伝子型と免疫形質値との関連解析を行い、高免疫豚型プロモーターの免疫能への影響を明らかにすることを予定している。
最終目的である、「高免疫豚マーカー」の開発を行い、国内豚商用集団における簡便な高免疫豚選抜法を確立することに変更はない。
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| Causes of Carryover |
THP-1細胞の培養を予定通りに行うことが出来ず、培地等の関連消耗品の使用額が少なかったことが、次年度使用額が生じた原因であると考えている。次年度は、当初計画にはなかった、不死化ブタ腎臓由来マクロファージの培養や、高免疫豚造成3世代目のDNAを用いた遺伝子型判別の実験を予定しており、そのためへの使用を考えている。
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