外来遺伝子高発現オルソブニヤウイルス作出技術の確立に関する研究

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K08074
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 上間 亜希子 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 特任助教 (20630156)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 堀本 泰介 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 教授 (00222282) ; 村上 晋 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 准教授 (10636757)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 改変型AKAV / 転写プロモーター活性の増強

Outline of Annual Research Achievements

本研究目的は、外来遺伝子高発現オルソブニヤウイルス作出技術の確立である。外来遺伝子として容易に検出できるGFPを用いて、これを効果的に発現するアカバネウイルス（AKAV）の作出を試みる。
これまでに、蛍光発現AKAV（eGFP-AKAV）のS分節5′ UTRの3′側領域をstop signalまで削ったウイルス（eGFP-AKAV/42）が作製されており、このウイルスは、培養細胞でeGFP-AKAVよりも蛍光発現時期が早いことが確認できている。今年度は新たに、eGFP-AKAV/42のS分節からさらに1塩基ずつ削っていった9種類の5′ UTR 欠損S分節プラスミドを作製した。これら各プラスミドとLおよびM RNA発現プラスミドをT7ポリメラーゼ恒常発現BHK-T7/9細胞に遺伝子導入することで、8種類のウイルスが回収できた。回収できたウイルスのRNAを抽出しシーケンス解析で塩基配列を確認したところ、欠損領域の多い4種類のウイルスでS分節に変異が入っていた。変異の入っていなかった4種類のウイルスはそれぞれ、5′ UTRのうち80～83塩基を欠損させたものであり、感染性ウイルスの産生に必須である5′ UTR領域を突き止めることができた。
作製した蛍光AKAVは全て、CPE発現の前に蛍光を検出できており、改変前のeGFP-AKAVよりも蛍光発現時期が早かった。5′ UTRを欠損させたことで、アンチゲノムからの転写プロモーター活性が増強し、GFP遺伝子の発現が上昇した可能性がある。これまでに、同じオルソブニヤウイルスのブニヤンベラウイルス（BUNV）で、S分節の5′ UTRを削ると転写・複製効率が下がるというミニゲノムアッセイの報告があるが、本研究結果から感染性ウイルスでは異なることが示唆された。これはオルソブニヤウイルスのUTRに関する新たな知見である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成29年度の計画は、eGFP-AKAVの5′ UTR 欠損S分節プラスミドライブラリーを作製し、5′ UTR欠損AKAVライブラリーを作製することであった。
eGFP-AKAVのS分節5′ UTR を79塩基欠損させて作出した、eGFP-AKAV/42のS分節をもとに、さらに1塩基ずつ欠損させた9種類の5′ UTR 欠損S分節プラスミドを作製した。これらを用いてウイルスレスキューを試みたところ、変異の入っていない4種類のウイルスが回収できた。これらのウイルスはそれぞれ、5′ UTRのうち80から83塩基を欠損したもので、感染細胞で蛍光が検出できている。また感染細胞の観察で、従来の蛍光AKAVよりも蛍光発現時期が早いことが確認できている。以上より、本研究は当初の計画通りに順調に進捗している。

Strategy for Future Research Activity

作出したウイルスについて、in vitroおよびin vivoの詳細な解析を行っていくことで、蛍光を最も効果的に発現するウイルスを見つける。
平成30年度は、作出したウイルスのin vitroでの性状を解析する。5′ UTR欠損部位の多い組換えAKAVを用いて、eGFP-AKAV/42および改変前のeGFP-AKAVと以下の項目について比較する。1. 増殖性：感染細胞での力価測定、増殖曲線、プラックの大きさを調べる。2. 蛍光発現時期の解析：感染24時間後および48時間後の蛍光領域を比較する。また、蛍光免疫染色でAKAV感染領域での蛍光発現率を調べる。3. 安定性：作出ウイルスを10代まで継代し、蛍光検出できたプラック率を継代数ごとに比較して、挿入遺伝子が安定して発現しているかを調べる。4. また蛍光発現時期の違いについて、その原因解明のために、培養細胞でのゲノムの転写・翻訳能をノーザンブロッティングで調べる。
in vitro性状解析が終わり次第、in vivoでの性状解析を行う（平成31年度予定）。蛍光を最も効果的に発現するウイルスをマウスに感染させ、eGFP-AKAVとの病原性を比較する。新生子マウスに腹腔内接種し、一日一回以上症状と生死を観察し、生存曲線を描く。マウスに致死性を示した場合、瀕死期の臓器（腹腔内臓器、胸腔内臓器、脊髄、脳など）を蛍光実体顕微鏡で観察し、蛍光検出を試みる。致死性を示さない場合でも、感染後、継時的に解剖し、同じく蛍光実体顕微鏡で蛍光検出を試みる。