Establishment of novel testicular toxicity evaluation system using medaka

2019 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17K08078
• Research Institution: Okayama University of Science
• Principal Investigator: 杉山 晶彦 岡山理科大学, 獣医学部, 教授 (00432609)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: メダカ / 精巣 / メトトレキサート / 細胞増殖抑制 / 細胞周期停止 / 精原細胞 / 精母細胞

Outline of Annual Research Achievements

精巣毒性物質メトトレキサートのメダカ胚・仔魚期曝露が精巣の発達に及ぼす影響およびその作用機序の解明を目的とし、Stage 17の初期胚 (器官形成期)から孵化後20日まで連続的にメトトレキサートに曝露させたメダカの精巣組織を、個体が成魚に成長するまで経時的に解析をおこなった。具体的には、①組織形態(ヘマトキシリン・エオジン染色)、②精巣構成細胞における細胞死誘導 (TUNEL染色、cleaved caspse-3免疫組織化学染色)、③精巣構成細胞における細胞増殖抑制(phospho-histone H3、PCNA免疫組織化学染色)、④精巣組織における精巣構成細胞特異的因子(TP1、TP2、TH2B、P19、Oct3/4、FSHR、LHR m-RNA)の発現状況 (リアルタイムPCR法)、⑤精巣組織におけるアポトーシス関連因子 (Bax、Bad、Bak、Bid、Bim、Fas、Fas-ligand　m-RNA)の発現状況 (リアルタイムPCR法)、⑥精巣組織におけるCyclin dependent kinase 阻害因子(p21、p15、p16、p18、p19、p27、p57 m-RNA)の発現状況 (リアルタイムPCR法)、⑦精巣組織におけるp53 m-RNAの発現状況 (リアルタイムPCR法)に関して解析を実施した。メトトレキサートの曝露を受けたメダカの精巣は顕著に矮小化し、精原細胞および精母細胞は有意に減数していた。また、精原細胞および精母細胞におけるphospho-histone H3およびPCNA陽性率は有意に低下していた。また、メトトレキサートの曝露を受けたメダカの精巣では、Cyclin dependent kinase 阻害因子p21およびp16 m-RNA発現の有意な増大および精原細胞特異的因子Oct3/4 m-RNA発現の有意な減少が認められた。