2017 Fiscal Year Research-status Report

Application of whole genome sequence analysis for the risk assessment of Shiga Toxin producing Escherichia coli derived from deer

Research Project

Project/Area Number	17K08087
Research Institution	Nihon University
Principal Investigator	壁谷英則日本大学, 生物資源科学部, 准教授 (10318389)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	横山栄二千葉県衛生研究所, 細菌研究室, 室長 (40370895)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	志賀毒素産生大腸菌 / 全ゲノム解析 / 野生動物 / 鹿 / 猪 / ジビエ
Outline of Annual Research Achievements	2016年9月から2018年4月までに、鹿89頭、猪146頭から収集した直腸便を採取した。各糞便からSTEC、ならびにO157 STECの分離を行った。各培地上の大腸菌のうちstx遺伝子を保有する株をSTECとした。 2012-2015年の間にわが国の鹿から分離し、制限酵素XbaＩ、BlnＩを用いたパルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）において、異なるプロファイルを示した12D102-4株と15D8-1株について、次世代シークエンサーにより全ゲノム解析を行った。その結果、11頭（12.4％）の鹿から19株のSTECが、3頭(2.1%) の猪から5株のSTECが分離された。鹿由来株はいずれもnon-O157であったが、猪2頭から分離された4株はO157 STECであったが。stxの内訳は、鹿由来株ではstx1のみが4株、stx2のみが15株、さらに eaeA (+)は1株、hlyA (+)は9株であった。猪由来株では、stx2のみが4株、stx1＋stx2が1株、さらに eaeA (+)は4株、hlyA (+)は4株であった。 12D102-4株と15D8-1株の全ゲノム解析では、いずれの株も塩基配列の決定されない領域（ギャップ）を残したものの、12D102-4株は5,364,531bp、15D8-1株は5,371,720bpの塩基配列であった。SerotypeFinder 1.1の成績から、検討した2株はいずれもO157:H7と、実際の血清型と一致した。ResFinder 3.0の成績から、検討した全ての株は、いずれも薬剤耐性遺伝子は検出されず、また薬剤感受性試験においても、検討した全ての薬剤に感受性を示した。VirulenceFinder 1.5の成績から、12D102-4株は20個、15D8-1株は21個の病原関連遺伝子が検出され、いずれもeaeが検出された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本研究では、日本全国で捕獲された野生鹿、ならびに野生猪を対象として志賀毒素産生大腸菌（STEC）の分離を行い、得られた鹿由来STEC分離株について、全ゲノム解析による人ならびに牛由来STECとの比較ゲノム解析を実施する計画である。これらの目的のため、平成29年度では、さらなる検体数を増やすことにより、より多様性に富む鹿由来STECを分離することができた。特に、猪の検体についての検討が進んだ。鹿由来O157STEC分離株はこれまでに9検体由来9株得られていたが、本年度の研究により、初めて猪からO157 STECが4株分離された。本年度は予備的な検討として、2株の鹿由来O157分離株の全ゲノム解析を実施し、ドラフト配列を得ることができ、一連の網羅的病原関連遺伝子解析を実施することができたことから、今後、対象を広げ、同様に全ゲノム解析を実施する見通しを立てることができた。以上から、本研究課題の研究目的に対して、概ね順調に進展していると考えた。
Strategy for Future Research Activity	平成30年度は、引き続き、検体収集、STEC分離培養、生化学性状解析を継続して実施するとともに、これまでに検体数の比較的少ない地域については新たな研究協力を要請することを検討する。一方、平成29年度の研究により分離された猪由来STEC O157の全ゲノム解析を実施する。また、当該猪の捕獲された地域周辺には牧場がある。当該牧場から協力が得られれば、飼育している家畜からもSTECの分離を試み、分離株が得られれば、同様に全ゲノム解析を実施し、当該猪分離株との比較解析を試みる。さらには、これまでに得られたわが国の鹿、および猪由来non-O157 STEC分離株から、病原性が疑われるnon-O157 STEC分離株、あるいは地域別等比較する基準を設定し、これらの分離株について網羅的な病原関連遺伝子の探索、および比較ゲノム解析を実施する。