2017 Fiscal Year Research-status Report

自然免疫制御能の異なるペスチウイルスの共存に起因する感染特性の分子基盤研究

Research Project

Project/Area Number	17K08088
Research Institution	Nippon Veterinary and Life Science University
Principal Investigator	青木博史日本獣医生命科学大学, 獣医学部, 准教授 (10440067)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	ペスチウイルス / 自然免疫制御 / IFNAR1ノックアウト細胞
Outline of Annual Research Achievements	自然免疫制御とペスチウイルス間相互反応を解析するため、ウイルス遺伝子型ごとに自然免疫制御能の異なるウイルスの単離を進め、特にBVDV-2型について重点的に実施した。KZ91NCP株から、限界希釈法で自然免疫制御型（END陽性型）ウイルスKZ91NCP＋を、逆プラック法で自然免疫抑制型（END陰性型）ウイルスKZ91NCP－をそれぞれ単離した。KZ91NCP－の遺伝子解析の結果、ゲノム全長12,286 塩基、推定アミノ酸数3,897個をコードする１個のオープンリーディングフレームを有することを確認した。KZ91NCP＋の予測遺伝子配列と比べ、KZ91NCP－に非同義置換が７ヶ所見つかり、うち１つは自然免疫制御関連蛋白Npro領域に位置し、自然免疫制御とウイルス間相互反応の解析において重要な鍵になると期待された。次いで、KZ91NCP－の完全長cDNAクローンの構築を進め、ウイルスゲノムの97%相当のcDNAをリバースジェネティクス用プラスミドベクターに挿入した。完全長cDNA の分子クローニングを達成した暁には、遺伝的に均一な各ウイルス集団を実験に用いることができる。自然免疫によらない内因性干渉とウイルス間相互反応を解析するため、ゲノム編集ツールのCRISPR／Cas9システムを用いて、牛インターフェロンαβ受容体サブユニット１（IFNAR1）ノックアウト牛腎培養細胞の作製を進めた。IFNAR1遺伝子配列をもとに、オフターゲットリスクが少ないと予測されたガイドRNA（gRNA）３種類を設計し、そのgRNAとCas9を同時に発現するプラスミドベクターを構築し、牛腎由来株化MDBK細胞内で導入し、各々発現させた。プラスミドが導入された培養細胞を確認できたことから、IFNAR1ノックアウト細胞のシングルセルクローニング及び性状確認を進めた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason KZ91NCP－ウイルスRNAからcDNA を合成し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いてウイルス遺伝子を５断片に分けて増幅した後、In-Fusion法によりpACYC177由来リバースジェネティクス用プラスミドベクターに順次連結しながら挿入し、分子クローンpKZ91NCP―の作製を進めた。完全長cDNAクローンの作製過程において、プラスミドベクターへのウイルス遺伝子断片の挿入・連結が進むにつれて、当該ベクターのIn-Fusion効率及び複製効率が低下し、さらに大腸菌体内での不安定性が高まったため、その構築に当初計画より時間を要しており、やや遅れていると判断した。ただし、完全長cDNA クローン完成までには3’末端338塩基の連結を残すのみであり、完成は近いと考える。 IFNAR1ノックアウト細胞の作製においては、gRNAの設計、gRNAスクリーニング、並びにgRNA－Cas9同時発現プラスミドベクターの構築などは順調に進んだ。しかし、当該プラスミドベクターをリポフェクション法で牛腎株化MDBK細胞への導入した際、様々なリポフェクション試薬の使用を試みても牛腎細胞への導入効率が数％と非常に低く、最も高いものでも10%に満たなかった。このため、IFNAR1ノックアウト候補細胞のシングルセルクローニングにおいて困難を極め、結果として時間を要していることから、当初計画よりやや遅れていると判断した。
Strategy for Future Research Activity	KZ91NCP－ウイルスゲノム長の3%に相当する残り338塩基の遺伝子断片を連結して完全長cDNAクローンを完成させ、リバースジェネティクス系によりKZ91NCP－の分子クローニングを達成し、早期に遺伝的に均一なKZ91NCP－ウイルス集団を作製する。その後は、当初計画とおり自然免疫制御能が拮抗するウイルスのウイルス間相互反応の実験を遂行する。 IFNAR1ノックアウト候補細胞のシングルセルクローニングを早期に達成させ、目的細胞の作製を早期に達成する。特に、gRNA－Cas9同時発現プラスミドベクターのMDBK細胞への導入方法、シングルセルクローニング方法について、効率の良い手法を検討し、実行する。その後は、IFNAR1ノックアウト細胞の選定と性状確認に重点を置き、次いで、当初計画通り自然免疫制御能によらないウイルス間相互反応の分子機序の解明の実験に展開する。
Causes of Carryover	ウイルス合成系のための分子クローンの構築、並びにIFNAR1ノックアウト候補細胞のシングルセルクローニングに伴い培養に時間を要したことに伴い各々培養が継続し、進捗に遅れが生じたため、繰越金が生じた。これらの作業の継続、特にウイルス合成及びIFNAR1ノックアウト細胞の性状確認のために使用する。