犬の消化管上皮細胞の新規培養技術の確立と各種消化管疾患ライブラリーの構築

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K08092
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 大田 寛 北海道大学, 獣医学研究院, 講師 (50431333)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 犬 / 消化管 / オルガノイド / 三次元培養 / 疾患ライブラリー

Outline of Annual Research Achievements

今年度は健常犬の結腸オルガノイドの培養手法の確立を継続するとともに、十二指腸のオルガノイドの培養手法の確立を試みた。まず犬の十二指腸の内視鏡生検サンプルを５つほど採取し（一つあたり10mg程度）、それを材料として十二指腸絨毛基底部に存在する幹細胞を含む腸陰窩の分離を試みた。十二指腸由来の腸陰窩の分離には結腸由来の腸陰窩分離と同様の手法を用いた。しかしながら、十二指腸の絨毛からの幹細胞を含む腸陰窩の分離効率が悪く、良好な幹細胞の採取が達成されなかった。そのため十二指腸由来オルガノイドの培養が達成されなかった。これらの結果より、十二指腸由来の幹細胞分離に用いる溶媒の組成の再検討や生検サンプルの採取量を10個程度に増やすなどの改善を行い、十二指腸粘膜由来の幹細胞の分離・培養を試みる必要があることが明らかになった。加えて、臨床症例の消化管粘膜生検サンプルの採取・保存も継続した。本年度は、ミニチュア・ダックスフンドの炎症性結直腸ポリープの3症例の結直腸のポリープ病変部ならびに非ポリープ病変部の生検組織をオルガノイド培養のため凍結保存した。また、様々な犬種のリンパ球形質細胞性腸炎の5症例の十二指腸粘膜を凍結保存した。同様に、結腸腺癌の2症例の病変部の生検組織も凍結保存を行った。これらの凍結保存組織は、十二指腸ならびに結腸のオルガノイド培養手法の確立後に凍結融解し、幹細胞分離およびオルガノイドの培養に利用可能である。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

当初の予定では、本年度中に健常犬の結腸由来オルガノイドならびに十二指腸由来オルガノイドの培養条件の確立を行う予定であった。しかしながら、十二指腸の幹細胞の良好な分離を達成できずオルガノイド培養手法の確立に至らなかった。

Strategy for Future Research Activity

他の動物種で報告されている消化管オルガノイドの培養手法を参考に条件設定を行ってきたが良好な成果が得られなかった。近年報告された犬の消化管由来オルガノイドの培養手法を参考にして、犬の結腸ならびに十二指腸の幹細胞分離ならびに培養条件の再検討を行う。

Causes of Carryover

今年度は十二指腸の絨毛基底部に存在する幹細胞の分離条件の検討に時間を要したため培養の段階で用いる成長因子・増殖因子等の試薬の購入に要する支出が少なくなったため次年度使用額が生じた。