Establishment of high-quality novel ES / iPS cells that precisely reflect the in vivo state

2019 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17K08135
• Research Institution: Shiga University of Medical Science
• Principal Investigator: 築山 智之 滋賀医科大学, 動物生命科学研究センター, 特任准教授 (60612132)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: カニクイザル / 多能性幹細胞 / ES細胞 / iPS細胞 / ゲノム編集 / CRISPR/Cas9

Outline of Annual Research Achievements

In vivoの状態を忠実に反映した高品質な新型ヒトおよびカニクイザルES・ iPS細胞を樹立するためのレポーターを作製し、カニクイザルES細胞へのレポーターノックインを行った。この過程で、新たに樹立したカニクイザルES細胞株(Seita Y., Tsukiyama T. et al., Biology of Reproduction)、ならびに実験初心者でも容易に培養できるよう工夫したレポーター入りのカニクイザルES細胞株(Kobayashi K., Tsukiyama T. et al., Stem Cell Research)を樹立し、それぞれ論文として報告した。また、狙った標的部位に変異を持つノックアウトカニクイザルの作出を試み、常染色体優性多発性嚢胞腎(ADPKD)の主要な原因遺伝子であるPKD1遺伝子を欠損した遺伝子改変個体の作出に成功した。分子生物学的手法により、全頭において変異導入を確認した上、流産胎仔ならびに生存産仔を詳細に解析した結果、腎 臓、肝臓、膵臓における嚢胞発生が確認した。また、従来のマウスを用いた疾患モデルでは再現ができなかった幼若期からの嚢胞形成も確認された。これらの結果より、カニクイザルにおいて疾患モデルを作出することにより、マウスなどの小動物を用いた従来の疾患モデルよりも正確にヒトにおける病態を再現できることが示された。さらに、選択的アレルターゲティングによるヘテロ変異サルの効率的作出や、Floxed alleleノックインサル胚の作出に世界で初めて成功し、これらの成果を論文として報告した(Tsukiyama T., Kobayashi K., Nakaya M. et al., Nature Communications)。

Research Products

• [Journal Article] Generation of Transgenic Cynomolgus Monkeys Overexpressing the Gene for Amyloid-β Precursor Protein (2020)
  • Author(s): Seita Y., Morimura T., Watanabe N., Iwatani C., Tsuchiya H., Nakamura S., Suzuki T., Yanagisawa D., Tsukiyama T., Nakaya M., Okamura E., Muto M., Ema M., Nishimura M., and Tooyama I.
  • Journal Title: Journal of Alzheimer's Disease Volume: - Pages: -
  • DOI: 10.3233/JAD-191081
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Monkeys mutant for PKD1 recapitulate human autosomal dominant polycystic kidney disease (2019)
  • Author(s): Tsukiyama T. *, #, Kobayashi K. #, Nakaya M. #, Iwatani C., Seita Y., Tsuchiya H., Matsushita J., Kitajima K., Kawamoto I., Nakagawa T., Fukuda K., Iwakiri T., Izumi H., Itagaki I., Kume S., Maegawa H., Nishinakamura R., Nishio S., Nakamura S., Kawauchi A., and Ema M. *
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 10 Pages: 5517
  • DOI: 10.1038/s41467-019-13398-6
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Induction of the germ cell fate from pluripotent stem cells in cynomolgus monkeys† (2019)
  • Author(s): Sakai Y., Nakamura T., Okamoto I., Gyobu-Motani S., Ohta H., Yabuta Y., Tsukiyama T., Iwatani C., Tsuchiya H., Ema M., Morizane A., Takahashi J., Yamamoto T., and Saitou M.
  • Journal Title: Biology of Reproduction Volume: 102 Pages: 620～638
  • DOI: 10.1093/biolre/ioz205
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Generation of an OCT3/4 reporter cynomolgus monkey ES cell line using CRISPR/Cas9 (2019)
  • Author(s): Kobayashi K. #, Tsukiyama T. *, #, Nakaya M., Kageyama S., Tomita K., Murai R., Yoshida T., Narita M., Kawauchi A., and Ema M. *
  • Journal Title: Stem Cell Research Volume: 37 Pages: 101439～101439
  • DOI: 10.1016/j.scr.2019.101439
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Comprehensive evaluation of ubiquitous promoters suitable for the generation of transgenic cynomolgus monkeys† (2019)
  • Author(s): Seita Y., Tsukiyama T., Azami T., Kobayashi K., Iwatani C., Tsuchiya H., Nakaya M., Tanabe H., Hitoshi S., Miyoshi H., Nakamura S., Kawauchi A., and Ema M.
  • Journal Title: Biology of Reproduction Volume: 100 Pages: 1440～1452
  • DOI: 10.1093/biolre/ioz040
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Generating Vegfr3 reporter transgenic mouse expressing membrane-tagged Venus for visualization of VEGFR3 expression in vascular and lymphatic endothelial cells (2019)
  • Author(s): Watanabe C., Matsushita J., Azami T., Tsukiyama-Fujii S., Tsukiyama T., Mizuno S., Takahashi S., and Ema M.
  • Journal Title: PLOS ONE Volume: 14 Pages: e0210060
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0210060
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Disease modeling in cynomolgus monkeys using CRISPR/Cas9. (2020)
  • Author(s): Tsukiyama T.
  • Organizer: 日本発生生物学会
  • Invited
• [Presentation] CRISPR/Cas9を用いたカニクイザルにおける疾患モデリング (2020)
  • Author(s): 築山 智之
  • Organizer: 日本マーモセット研究会大会
  • Invited