2017 Fiscal Year Research-status Report
精子免疫ラットを用いた免疫系細胞による精子形成障害発症機序の解明
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17K08142
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| Research Institution | National Agriculture and Food Research Organization |
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Principal Investigator |
野口 純子 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, 主席研究員 (80189381)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 精子形成 / 自己免疫性精巣炎 / MHCクラスⅡ / T細胞 / 男性不妊 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々はラットに精子を抗原として２回接種し、高率で自己免疫性精巣炎（EAO）を誘起する手法を開発した。EAO精巣には精細管に炎症性サイトカインであるTNF-αを発現する細胞の付着が観察される。これらは免疫により活性化した感作Tリンパ球で、精細管に付着することで精子形成を障害すると予測している。細胞性免疫反応により精子形成が障害される機序を解明するため、EAO精巣から採取した細胞をフローサイトメトリーにより解析した。T細胞への抗原提示には細胞表面抗原MHCクラスⅡが必須だが、発症精巣には免疫系細胞（マクロファージ主体）とは異なるMHCクラスⅡ陽性細胞集団が検出された。
29年度はソーティングにより回収したこれらの細胞からRNAを抽出し、セルトリ細胞、間質細胞および精細管周囲ミオイド細胞が特異的に発現する遺伝子について定量的RT-PCRにより発現を検討した。その結果、免疫系細胞とは異なるMHCクラスⅡ陽性細胞集団にはセルトリ細胞とミオイド細胞が含まれる可能性を得た。そこで、この集団を構成する細胞を免疫染色により同定するため、各種細胞を特異的に染色する条件を検討した。その結果、セルトリ細胞をGATA1、GATA4（転写因子で核に陽性）およびCLAUDIN11（精巣のバリアを構成する因子）により、ミオイド細胞をCALPONIN（アクチンに結合し平滑筋収縮に関与）に対する免疫染色で同定する手法を開発した。
細胞性免疫反応による病態であることを確認するため、移入試験を試みた。近交系ラットを作出後、単回の精子接種を行うことでT細胞を感作し、リンパ節からこれらの細胞を回収して培養に供した。培養条件下で再度精子抗原と反応させた後、正常雄に１0^7個の細胞を移入したが精巣に病態は観察されなかった。今後、培養後の活性化の確認および発症に必要な活性化T細胞数を検討する必要がある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
自己免疫性精巣炎は細胞性免疫反応によると考えられているが、その発症機序の詳細は不明である。我々はこの炎症性免疫反応に関わる精巣側の細胞と免疫系細胞を同定することが精子形成障害発生機序の解明に不可欠と考えている。29年度は精巣側の細胞の絞り込みを進め、定量的遺伝子発現解析によりセルトリ細胞および精細管周囲ミオイド細胞がMHCクラスⅡを介して免疫系細胞を活性化する可能性を得た。更に、免疫染色により細胞を同定する手法を開発した。他方、精子形成を攻撃する免疫系細胞を特定するため、T細胞活性化培養系を確立し移入試験を試みた。移入後の精巣に発症を確認することはできなかったが、改良すべき点についての情報は得られた。こうしたことから、ほぼ順調に研究が進んでいると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
EAO発症に関する精巣側因子の解析
29年度までにセルトリ細胞と精細管周囲ミオイド細胞がMHCクラスⅡを発現する可能性を得た。これを確認するためEAO発症精巣からMHCクラスⅡ陽性細胞をフローサイトメトリーで検出し、ソーティングして採取する。採取した細胞をセルトリ細胞マーカーであるGATA1、GATA4（転写因子で核に陽性）およびCLAUDIN11（精巣のバリアを構成する因子）、また、ミオイド細胞のマーカーであるCALPONIN（アクチンに結合し平滑筋収縮に関与）の抗体を用いて免疫染色を実施する。
受動免疫によるEAO発症に関与する免疫系細胞の解析
29年度に開発した感作T細胞活性化培養は以下の手技である。活性化培養に用いる感作T細胞は、ラット後肢足蹠に精子を接種し約2週間後に腫大したリンパ節を採取して得る。ナイロンウールカラムを用い非接着性の細胞をT細胞として、抗原提示細胞として別途正常ラットの脾臓から採取した細胞と共培養する。このとき抗原物質を添加することで脾臓細胞が抗原提示し、提示された抗原を認識するT細胞は活性化し分裂増殖する（刺激培養）。3日間の刺激培養後、増殖したT細胞を密度勾配を利用した遠心分離により回収し約1週間培養後（静止培養）、再び刺激培養を行った。こうした2種類の培養を繰り返すことで次第にT細胞の増殖能は亢進した。本年度は刺激培養の反復と分裂増殖能の変化について、MTTアッセイ等により明らかにする。また、培養液中のインターフェロンγをELISAで測定して活性化の状態を明らかにする。これらの結果に基づき確実に活性化したT細胞を移入試験に用いることで、受動免疫によるEAO発症を確認する。他方、培養により活性化した細胞について、細胞表面抗原CD3およびCD4の発現をフローサイトメトリーにより確認し、EAO発症に関与する免疫系細胞を同定する。
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| Causes of Carryover |
納入時の価格割引等により最終的に少額の残金が発生したが、次年度の物品購入に使用予定である。
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Research Products
(1 results)
