2018 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of severe disease mechanism using mouse model infected with dengue virus, developing the symptoms of vascular leakage and bone marrow suppression.
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17K08145
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| Research Institution | National Institute of Infectious Diseases |
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Principal Investigator |
黒須 剛 国立感染症研究所, ウイルス第一部, 主任研究官 (70432432)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | デングウイルス / 多臓器不全 / 血漿漏出 / 出血熱 / 感染動物モデル / サイトカインストーム / 全身性感染症 / 骨髄抑制 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
デングウイルス感染症は。血管透過性の亢進と血小板減少症を特徴とし、重症化すると血漿漏出により出血を伴うショック症状に陥る。その病原機序は明らかではなく、効果的な治療法・予防法はない。これまでに我々は血漿漏出と血小板減少症、骨髄抑制（巨核球と赤芽球島の消失）を観察できるデングウイルス感染新規マウスモデルの開発に成功しており、本研究では重症化機序を明らかにすることを目的とした。
これまでの遺伝子発現レベルでの研究から、血漿漏出を伴う重症化には２つの重要な現象が関与していることが明らかである。１）自然免疫に関係しているマクロファージ系細胞や好中球の活性化。２）IL-6産生増大とそれに伴う血管の透過性亢進。これは１）の結果であると考えられ、またIL-6産生増大が１）を増長していると考えられた。１）に関しての詳細な解析により、マクロファージの貪食作用が増殖していること、好中球数が増大していることが明らかになった。これはIL-6産生により好中球分化が促進され、好中球から分泌されるMMP8が血管透過性亢進に働いたと考えられた。IL-6の高産生に鍵となるのがIL-17Aの産生であることが確認され、IL-17A産生細胞が特定された。
研究開始当初、感染による血小板減少症機序には２つの可能性が考えられた。１）活性化されたマクロファージによる血小板もしくは巨核球前駆細胞の貪食。２）巨核球前駆細胞へのウイルス感染による細胞死。本研究結果から、感染後に腹腔由来のCD14陽性細胞での貪食能が亢進していることを確認した。一方で、巨核球・赤芽球前駆細胞へ感染してアポトーシスを起こしていることも判明した。２）の可能性は、骨髄切片において巨核球と赤芽球が劇的に減少しているという観察と一致する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
血漿漏出を伴う重症化機序に関しての詳細な機序が判明してきた。IL-6産生が重症化に非常に重要であるが、この高産生にはIL-17A産生が鍵となり、IL-17Aは胸腺と腸管に存在するgamma/delta T細胞から産生されることが明らかになった。腸管には腸管上皮細胞間としてもともとgammma/delta T細胞が存在するが、さらに爆発的に細胞数が増殖していた。この観察は非常に新規の知見である。
また感染マウスにIL-17AやMMPに対する阻害物質を用いてエバンスブルーを用いて血漿漏出の程度を確認したところ、これら阻害剤で特に腸管での漏出が抑制された。このことからも腸管が重症化に重要な役割を果たしていることが明らかになった。一方IL-6そのものの阻害は効果を認めなかった。IL-6阻害物質投与によっても、IL-6活性化の指標となる血清アミロイドAタンパク質産生が抑制されていなかったことからIL-6はこのモデルにおいては劇的な高値を示すため、この部分の阻害効果は低くなったと考えられる。
骨髄抑制（顕著な骨髄での巨核球消失と赤芽球消失）の原因は、これらの前駆細胞へのウイルス感染による細胞死である可能性が高い結果を得た。この細胞はCD34+/CD38+/CD123-を表面に発現しており、これは巨核球と赤血球へと分化する前の共通する細胞である。この現象を培養細胞系で観察するため、巨核芽球と赤芽球両方に分化可能なヒト由来K562細胞を用いてウイルス感染実験を行い、細胞死が起こることを確認した。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）これまでで最も重要な観察は、感染末期にgamma/delta T細胞が増殖し、IL-17Aを産生することである。IL-17Aの阻害により致死率は半減する。最大の疑問は、なぜ、いつgamma/delta T細胞が活性化されるかである。ウイルスが直接この細胞に感染することによるのか、それとも他のウイルス側および宿主側因子が関与しているか疑問が残っている。ヒトのGamma/delta T細胞のリガンドとしてある種のリン酸化合物が報告されているが、未だ詳細は明らかになっていない。この細胞がどのような刺激によって分化・増殖を始めるかもわかっていない部分が多い。今後の課題として、なぜデングウイルス感染によりgamma/delta T細胞が増殖し、活性化したのかin vitro/in vivoの系を用いて明らかにする。
（２）巨核球・赤芽球前駆細胞へのデングウイルス感染が細胞死を引き起こしているが、なぜ細胞死を引き起こしているか不明である。今後は他の骨髄細胞に感染しているのか、感染しているのに細胞死を起こしていないのか感染マウスから得られた骨髄細胞を用いたフローサイトメトリー解析により明らかにする。また、感染した巨核球・赤芽球前駆細胞への感染が細胞死を起こす機序を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
効率よく実験できたことと、論文発表の時期を遅らせたため使用額が予定より少なくできた。より詳細を明らかにするために、論文発表を2019年に延ばした。2018年度使用しなかった研究費は、実験に加え、2019年6月に国際学会（Keystone conference）で発表するための旅費、論文投稿費用などに使用する。
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