2019 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of severe disease mechanism using mouse model infected with dengue virus, developing the symptoms of vascular leakage and bone marrow suppression.
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17K08145
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| Research Institution | National Institute of Infectious Diseases |
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Principal Investigator |
黒須 剛 国立感染症研究所, ウイルス第一部, 主任研究官 (70432432)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | デングウイルス / サイトカインストーム / 感染動物モデル / 出血熱 / 多臓器不全 / 血漿漏出 / 全身性感染症 / 骨髄抑制 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
デングウイルス感染症は。血管透過性の亢進と血小板減少症を特徴とし、重症化すると血漿漏出により出血を伴うショック症状に陥る。その病原機序は明らかではなく、効果的な治療法・予防法はない。これまでに我々は血漿漏出と血小板減少症、骨髄抑制（巨核球と赤芽球島の消失）を観察できるデングウイルス感染新規マウスモデルの開発に成功しており、本研究では重症化機序を明らかにすることを目的とした。
これまでの遺伝子発現レベルでの研究から、血漿漏出を伴う重症化には２つの重要な現象が関与していることが明らかである。１）自然免疫に関係しているマクロファージ系細胞や好中球の活性化。２）IL-6産生増大とそれに伴う血管の透過性亢進。これは１）の結果であると考えられ、またIL-6産生増大が１）を増長していると考えられた。１）に関しての詳細な解析により、マクロファージの貪食作用が増殖していること、好中球数が増大していることが明らかになった。IL-6産生細胞とIL-17A産生細胞がフローサイトメトリー解析により特定された。この中でもIL-17A産生がサイトカイン産生亢進を制御していることが判明した。IL-17A産生細胞にはいくつかあるが、サザンブロット解析によりある特定の型の細胞が感染によって増殖していることが判明した。この細胞は最もIL-17A産生が認められた臓器にはもともといなかった細胞であり、多臓器から流入してきたと考えられた。
研究開始当初、感染による血小板減少症機序には２つの可能性が考えられた。１）活性化されたマクロファージによる血小板もしくは巨核球前駆細胞の貪食。２）巨核球前駆細胞へのウイルス感染による細胞死。本研究結果から、感染後に腹腔由来のCD14陽性細胞での貪食能が亢進していることを確認した。一方で、巨核球・赤芽球前駆細胞へ感染してアポトーシスを起こしていることも判明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
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血漿漏出を伴う重症化機序に関しての詳細な機序が判明してきた。IL-6産生が重症化に非常に重要であるが、この高産生にはIL-17A産生が鍵となり、IL-17Aは胸腺と腸管に存在するgamma/delta T細胞から産生されることが明らかになった。腸管には腸管上皮細胞間としてもともとgammma/delta T細胞が存在するが、さらに爆発的に細胞数が増殖していた。この細胞の活性化機序を解明するため、T細胞受容体（TCR）の遺伝子型をサザンブロット解析した。この細胞はもともと腸管に存在した細胞ではなく、他のリンパ組織からホーミングしてきた可能性が考えられた。しかし、gamma/delta T細胞のこのような現象は報告されておらず、急性感染における特異的な未解明の機序がある可能性が考えられた。またマイクロアレイの解析結果から、細胞の活性化を誘導するレセプター候補が得られ、フローサイトメトリー解析によりおよその見当がつけられた。
また感染マウスにIL-17AやMMPに対する阻害物質を用いてエバンスブルーを用いて血漿漏出の程度を確認したところ、これら阻害剤で特に腸管での漏出が抑制された。このことからも腸管が重症化に重要な役割を果たしていることが明らかになった。一方IL-6そのものの阻害は効果を認めなかった。IL-6阻害物質投与によっても、IL-6活性化の指標となる血清アミロイドAタンパク質産生が抑制されていなかったことからIL-6はこのモデルにおいては劇的な高値を示すため、この部分の阻害効果は低くなったと考えられる。IL-の阻害は慢性の自己免疫疾患治療には有効であることが示されているが、急性感染症によるサイトカインストームでは大過剰産生されるため、他の経路を阻害する方が高い効果を得られるかもしれない。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）これまでで最も重要な観察は、感染末期にgamma/delta T細胞が増殖し、IL-17Aを産生することである。IL-17Aの阻害により致死率は半減する。最大の疑問は、なぜ、いつgamma/delta T細胞が活性化されるかである。ウイルスが直接この細胞に感染することによるのか、それとも他のウイルス側および宿主側因子が関与しているか疑問が残っている。ヒトのgamma/delta T細胞のリガンドとしてある種のリン酸化合物が報告されているが、未だ詳細は明らかになっていない。この細胞がどのような刺激によって分化・増殖を始めるかもわかっていない部分が多い。
この機序解明のために増殖してIL-17A産生している細胞の型を決定した。細胞の型により増殖・活性化につながるgamma/delta T細胞上のレセプター、そこに働くリガンドがある。マイクロアレイ解析と合わせた結果から、gamma/delta細胞のレセプターに関しての予想が立っている。しかし、これまでの報告のTCR型別との組み合わせとは異なっていた。今後、感染マウスからgamma/delta T細胞を採取し、このレセプターに対するリガンドによって再刺激後のIL-17A産生を確認する。またこの細胞が他のリンパ組織に由来するが、どの組織において初めに発生したか確認する。また多臓器に存在するgamma/delta T細胞と腸管に存在するgamma/delta T細胞のホーミングに係る分子の発現を比較し、なぜ腸管に非常に多く集まっているかを明らかにする。
さらなる詳細な解析のため、gamma/delta T細胞の不死化し、再刺激に対する応答、TCR刺激や他のリガンドによる刺激に対する応答を確認する。
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| Causes of Carryover |
効率よく研究を行ったため、当初予定の経費を削減できた。また研究が進展したため追加実験と論文投稿に経費が必要となった。
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Research Products
(5 results)
