Analysis of severe disease mechanism using mouse model infected with dengue virus, developing the symptoms of vascular leakage and bone marrow suppression.

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K08145
• Research Institution: National Institute of Infectious Diseases
• Principal Investigator: 黒須 剛 国立感染症研究所, ウイルス第一部, 主任研究官 (70432432)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: デングウイルス / 重症化 / 全身性感染症 / 多臓器不全 / 血漿漏出 / サイトカインストーム / 出血熱 / 感染動物モデル

Outline of Annual Research Achievements

デングウイルス感染症は。血管透過性の亢進と血小板減少症を特徴とし、重症化すると血漿漏出により出血を伴うショック症状に陥る。その病原機序は明らかではなく、効果的な治療法・予防法はない。これまでに我々は血漿漏出と血小板減少症、骨髄抑制（巨核球と赤芽球島の消失）を観察できるデングウイルス感染新規マウスモデルの開発に成功しており、本研究ではこのモデルを用いて重症化機序を明らかにすることを目的とした。
血症漏出を伴う重症化には宿主の過剰な防御反応、いわゆるサイトカインストームが関与していると考えられている。TNF-α阻害のよりマウスが防御されることから、本モデルでもサイトカインストームにより重症化していると考えられた。詳細な網羅的解析から、病態進行の中で最も鍵になるのが、IL-17A産生であることが明らかになった。IL-17Aは、強い炎症作用があるIL-6の過剰産生を促進している分子であった。IL-17Aを産生する細胞はいくつか知られているが、自然免疫と獲得免疫の両方の性質を持つガンマ・デルタT細胞により産生されていた。活性化されているガンマ・デルタT細胞の詳細について検討することで、ガンマ・デルタT細胞活性化機序解明の手掛かりになると考えられた。
通常のT細胞は、T細胞受容体が抗原提示細胞に発現する抗原の断片を載せたMHCを認識し、活性化・増殖する。ガンマ・デルタT細胞の活性化にもT細胞受容体が使用されることもあるが、MHC分子ではなく直接抗原や宿主のストレス因子を認識することが知られている。また、T細胞受容体以外の細胞表面分子によっても活性化される。本年度は、以上を解析した。
さらにサイトカインストームの下流に動く、エフェクター細胞とエフェクターについて解析を行った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

血漿漏出を伴う重症化機序に関しての詳細な機序が判明してきた。IL-6産生が重症化に非常に重要であるが、この高産生にはIL-17A産生が鍵となり、IL-17Aは胸腺と腸管に存在するガンマ・デルタT細胞から産生されることが明らかになった。腸管には腸管上皮細胞間としてもともとガンマ・デルタT細胞が存在するが、さらに爆発的に細胞数が増殖していた。この細胞の活性化機序を解明するため、T細胞受容体（TCR）のVガンマ鎖遺伝子をRT-PCRサザンブロット解析により型別した。マウスのガンマ・デルタT細胞はTCRのガンマ鎖遺伝子から、7つのタイプに分類され、臓器特異的な分布を示す。最も血漿漏出が激しかった腸管では、4つの型のガンマ鎖を発現するガンマ・デルタT細胞が増殖しており、そのうち２つの型は、もともと腸管には存在していない細胞であった。ガンマ・デルタT細胞は、ナイーブガンマ・デルタT細胞から異なる刺激によってIL-17A産生ガンマ・デルタT細胞とIFN-γ産生ガンマ・デルタT細胞に分化するが、この2種はIL-17A産生することが報告されている。意外なことに、腸管で増殖していたガンマ・デルタT細胞と同じセットの増殖が胸腺と脾臓で認められた。これは腸管でIL-17Aを産生している細胞ガンマ・デルタT細胞は、胸腺から移動してきたと考えられた。感染初期にTCR-MHC相互作用なしに、ウイルス非特異的にナイーブガンマ・デルタT細胞へと分化し、腸管へ移動したと考えられた。
一方、サイトカインストームの効果を受ける、エフェクター細胞は好中球である可能性が高いと考えられる結果を得た。また特異的に発現するマトリックスプロテアーゼを同定した。

Strategy for Future Research Activity

（１）これまでで最も重要な観察は、感染末期にガンマ・デルタT細胞が増殖し、IL-17Aを産生することである。ガンマ・デルタT細胞が活性化の詳細機序を明らかにすることが最優先事項であり、これまでのところT細胞受容体以外の受容体が活性化・増殖の刺激になっていることが判明している。今後はこれまで報告のあった他の活性化受容体、Toll-likeレセプターやレクチンなどの関与について検討する。まずこれら分子の発現後の発現レベルについて定量RT-PCR法とフローサイトメトリー法により調べる。その後、ガンマ・デルタT細胞を分離し、それぞれの受容体のリガンドとして報告されている分子により刺激することでIL-17A産生を刺激するか確認する。受容体が明らかになった場合、本モデルにおける受容体に対するリガンドは何かを同定するため、分離ガンマ・デルタT細胞へウイルス因子、宿主因子を加えて、リガンドの同定を行う。
（２）どこの臓器にエフェクターになる細胞が集まるかは症状を理解する上で重要である。本モデルではガンマ・デルタT細胞がいかに腸管に集まってきたか、ホーミングに関する機序を解明する。候補ケモカイン分子発現を定量RT-PCR法とフローサイトメトリー法により調べる。また分離したガンマ・デルタT細胞を用いてin vitroにおけるケモタキシス・アッセイを行いリガンドのケモカインを同定する。
（３）エフェクター候補分子としてMMPを特定したが、このMMPはまだ血漿漏出を起こすという報告がない。そこでこのMMPがTight Junctionのタンパク質を破壊できるかなどの基礎的な情報を集める。

Causes of Carryover

コロナ感染拡大によるテレワーク推進などのため、実験が遅れた。また学会などのオンラインだったため。また論文発表用の経費が必要なため。