2017 Fiscal Year Research-status Report
Generic cell ablation system: sterile-insect technique for control of infectious disease vector and prevention of leakage of beneficial insect strains
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17K08161
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| Research Institution | National Agriculture and Food Research Organization |
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Principal Investigator |
笠嶋 めぐみ 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, 研究員 (90458290)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山本 大介 自治医科大学, 医学部, 講師 (90597189)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 遺伝子ノックイン / ゲノム編集 / 組織特異的発現 / 不妊化 / SIT |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生殖に関わる特定の細胞や時期にGal4が発現できるような組換えカイコを樹立するため、本年度は以下のような実験を行なった。
はじめにターゲット遺伝子として、生殖巣特異的発現遺伝子を探索するために、RNAseqのデータを解析した。Gal4をノックインする遺伝子領域の選定を行う段階までが本年度の計画であった。妥当な候補遺伝子を数種類ピックアップし、組織特異的であるかどうかの発現解析を行なっているところである。具体的には、これらの候補遺伝子の発現特性についてRT-PCRなどを行い、標的遺伝子として最適かどうか判別を行なった。
次に、ターゲット領域にGal4遺伝子を挿入するために、これらの遺伝子についてカイコ実験系統であるwc系統のゲノムDNA配列をクローニングし、シーケンスを決定した。このようにノックインベクターを作成する準備は終えることができた。確かめたGenom DNA配列をもとに、ノックインに使用するdonor vectorを構築する予定である。
これとは別に、これまでの研究でカイコにおいて開発した細胞死誘導エフェクターが昆虫に汎用的に使用でき、不妊化技術に有用であることを示すために、マラリア媒介昆虫であるハマダラカのオス不妊系統を作出し、不妊化できることを確かめた。使用したエフェクター遺伝子は、細胞死誘導が可能なマウス由来のBax遺伝子である。この遺伝子を精巣特異的に発現させ、オス不妊になるか調べた。この蚊は精子が形成できず、不妊であることを確かめた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
カイコにおける組織特異的発現遺伝子の選択が思うように進まない。
生殖細胞において発現する遺伝子は、理由はわからないが、神経などの組織でも発現が認められる場合が多い。
また、有効な候補遺伝子であるものでも、ノックインベクターの構築に難がある（多型が多い領域や繰り返し配列がある）配列があり、絞り込みや当初の見込みよりも時間を要した。
しかしながら、概ね達成できているので今年度は計画通りに進めることができると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度に剪定したターゲット遺伝子のコード領域の開始メチオニン部位を特異的に切断するTALENを設計する。はじめに、設計したTALEN mRNAが目的領域を効率よく切断できるかG0世代の個体を解析して確かめる。現在作製しているdonor vectorとともにTALEN mRNAをカイコ胚に顕微注入し、部位特異的組換え個体を作出する実験に着手する。
この研究と並行して、病気媒介昆虫や有用昆虫を多く含むハチ目昆虫の生殖巣特異的遺伝子の同定とゲノム編集による変異体作成についての研究を行う。病気媒介昆虫としてはマラリアを媒介するハマダラカ、有用昆虫としてはセイヨウミツバチを用いる予定であるが、ゲノム情報が入手可能な近縁種も候補として、昆虫全般のゲノム編集技術の向上に貢献できるような成果を目指す。具体的には、ゲノムデーターベースを用い、カイコで標的とした遺伝子のオルソログを探索・同定し、発現部位について調べ、不妊化のターゲット遺伝子に適するか調べる。また、これらの遺伝子をターゲットとしたTALENを設計し、遺伝子を破壊できるか調べる。
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| Causes of Carryover |
やや実験計画が遅れていることもあり、消耗品を年度内に調達できなかった。今年度早々に使用し、本研究で使用する予定である。
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