2020 Fiscal Year Research-status Report

Generic cell ablation system: sterile-insect technique for control of infectious disease vector and prevention of leakage of beneficial insect strains

Research Project

Project/Area Number	17K08161
Research Institution	National Agriculture and Food Research Organization
Principal Investigator	笠嶋めぐみ国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, 上級研究員 (90458290)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	山本大介自治医科大学, 医学部, 講師 (90597189)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2022-03-31
Keywords	遺伝子ノックイン / ゲノム編集 / 組織特異的発現 / 不妊化 / SIT
Outline of Annual Research Achievements	バイナリシステムあるいは組織特異的発現プロモーターを利用した細胞死誘導は、基礎研究および昆虫の遺伝的防除方法への応用に有用である。我々のグループは、哺乳動物のプロアポトーシス因子であるBax（B-cell leukemia/lymphoma 2-associated X protein）を組織特異的に発現誘導することによって限定的にアポトーシスを誘導できることを示した。令和2年度はカイコメス特異的部位へのGal4のノックイン実験を実施した。カイコの性染色体はZW型と呼ばれるメスヘテロ型で、W染色体にメス決定因子がコードされている。しかしながら、その他の領域には、タンパク質をコードする遺伝子領域はなく、トランスポゾンが大量に挿入された繰り返し配列が散在しており、部位特異的ノックインのための標的領域を設定することが難しかった。そこで、すでに樹立されているW染色体にpiggyBacベクターが挿入されている系統に対してノックインを実施することにした。このpiggyBacには、マーカーとして3xP3プロモーターDsRed遺伝子があり、この領域を標的することで、眼のDsRedマーカーがノックインのマーカーとなる。すなわち、眼のDsRedの蛍光が消えた個体はノックイン個体として単離できる。この系統に、Gal4あるいは細胞死誘導エフェクター因子をノックインし、雌を致死する、あるいは性分化の撹乱を行うことを計画した。DsRedを標的とするノックインのためのTALENベクターを構築し、導入遺伝子を含むドナープラスミドとともにTALEN mRNAをカイコ胚にに注入し、ノックイン個体作成実験を実施した。現在、注射当代の個体をすべて飼育して、導入遺伝子を持つ個体（ノックイン個体）のスクリーニングを行っているところである。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason R2年度はコロナウイルスの感染拡大防止のため、5月から7月の時期は、主に在宅勤務となり、カイコを飼育することができなかった。カイコの系統は卵休眠するため、この在宅勤務期間をやり過ごすため、カイコ胚を休眠処理したため、さらにその後の実験スケジュールも遅れる結果となった。今年度は、今の所、勤務ができているので予定通り、ノックイン個体の単離を行う予定である。
Strategy for Future Research Activity	ノックイン実験はすでに実施しており、現在、目的のカイコのスクリーニングを進めているところである。系統が樹立できたのち、すでに樹立済みのmBaxをGal4依存的に発現する系統と交配して、目的組織あるいは時期に細胞死が誘導できるか検証する。
Causes of Carryover	ノックインカイコ系統作出については、連続的に飼育施設へ出勤して作業することが必須であるが、コロナによる社会情勢のため在宅勤務が続き、実施できなかったため、使用予定であった飼育器材や実験キット類の購入・使用とカイコ維持・飼育に係る人件費の消費については令和3年度に繰越し、本研究を続けることとした。現在、出勤でき、予定した実験をこなすことができており、令和３年度には計画通りに消費でき、研究計画をフィアナライズできると考えている。その他の予算について、海外旅費については、参加予定だった国際昆虫学会が今年度も開催を見送られることが発表されたため、国内における成果発表に変更し、残った予算はカイコの飼育器材の購入に当てる予定である。