2021 Fiscal Year Research-status Report

Generic cell ablation system: sterile-insect technique for control of infectious disease vector and prevention of leakage of beneficial insect strains

Research Project

Project/Area Number	17K08161
Research Institution	National Agriculture and Food Research Organization
Principal Investigator	笠嶋めぐみ国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, 上級研究員 (90458290)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	山本大介自治医科大学, 医学部, 准教授 (90597189)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2023-03-31
Keywords	遺伝子ノックイン / ゲノム編集 / 組織特異的発現 / 不妊化 / SIT
Outline of Annual Research Achievements	令和3年度は雌特異的部位へのGal4のノックイン（KI）実験を前年度に引き続き実施するとともに、CRISPR-Cas9による遺伝子ノックアウトについても実施した。すでに樹立されているW染色体に、piggyBacベクターが挿入されているカイコ系統に対してKIを実施するために、この系統を非休眠化して、顕微注入が可能なように継代を続けた。この系統のW染色体中に座するDsRedを標的とするKIのためのTALENベクターを構築し、導入遺伝子を含むドナープラスミドとともにTALEN mRNAをカイコ胚にに注入し、KI個体作成実験を実施した。注射当代の個体をすべて飼育して、導入遺伝子を持つ個体（KI個体）のスクリーニングを行ったがKI個体を得ることができなかった。これは、対象となる染色体を持つ個体が注射個体の半分（雌のみ）であるため、効率が通常の半分程度に落ち込むことに加えて、顕微注入の物理的刺激や操作上必要な低温での管理に耐えられなかったため、と考えられた。そこで、戻し交配を続け、系統の健全性を高め、顕微注入を実施しているところである。 CRISPR-Cas9による遺伝子ノックアウト（KI）については、ある機能未知遺伝子を標的として、ガイドRNAを４種類作成し、ノックアウト効率を調べた。野生型のカイコ系統の胚にガイドRNAおよびCas9タンパク質を注入し、注射当代G0個体の次世代（G1）胚のPCRによるジェノタイピングにより、切断効率を比較した。４種類のうち３種類は切断された個体は得られなかった。４種類のうち１種類は、様々なパターンで切断された個体の存在がPCRで確認でき、切断効率が高いことがわかった。CRISPR-Cas9による遺伝子KIの系は確立されていないため、今後は、この効率よく切断できた標的部位にKIを実施して、新たな遺伝子KIの系を構築する。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason R3年度は前年度のコロナウイルスの感染拡大防止のために在宅勤務となった影響から、カイコを飼育スケジュールが縮小してしまい、R4年度に入ってから前年度の影響を受けてカイコ系統のコンディションが低下した。そのため実験の実施が遅れる結果となった。今年度は遅れを取り戻し、実験を計画に沿って進める。
Strategy for Future Research Activity	ノックイン実験のためのカイコ系統にノックインベクターを顕微注入する実験を引き続き行い、ノックイン個体の選別単離を目指す。系統が樹立できたのち、すでに樹立済みのGal4依存的に蛍光タンパク質を発現する個体と荒廃して、雌のみに目的遺伝子を発現誘導できることを確かめる。また、樹立したノックイン系統が継代飼育できるかや、妊性が正常雌と大差がなく、系統維持が可能か調べる。
Causes of Carryover	使用予定であった理化学実験に必要なプレスチック製品が一時的に入手困難という状況になり、実験に遅れが生じた。その他の予算について、海外旅費については、参加予定だった国際昆虫学会を取りやめ、東ヨーロッパで開催される国際養蚕会議に出席の予定としているが、コロナ感染状況や国際情勢から参加については不明瞭な状況となった。参加できなくなった場合には、国内学会への参加に切り替えて成果発表を行う予定である。