2019 Fiscal Year Research-status Report
昆虫細胞によるバキュロウイルス非依存型高効率タンパク質発現系の構築
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17K08162
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
永峰 俊弘 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 専任研究員 (90237553)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | バキュロウイルス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、ウイルスによる宿主細胞のシャットオフ機構を解明し、得られた知見を基にして、昆虫細胞によるバキュロウイルス非依存型高効率タンパク質発現系を構築することを目的としている。当初は申請書の計画にしたがって、RNAiスクリーニングによるシャットオフ誘導遺伝子の同定を進めていたが、研究期間中、細胞の転写にliquid-liquid phase separation（LLPS）が重要な役割を果たしていることが明らかとなり、本研究の中心課題であるウイルスによる宿主細胞のシャットオフ機構の解明にもLLPS との関連からのアプローチが必要となってきた。LLPSには天然変性領域（IDR）間の相互作用が重要であることが明らかになっているので、昨年度は40残基以上のIDRを持つバキュロウイルスタンパク質18種のうち、VSあるいはPR局在が既に分かっているタンパク質のIDRを中心に解析を進めた。その結果、IE1によるLLPS形成には、IE1の構造変化が関わっている可能性が推測されたので、本年度はIE1の構造変化の詳細な解析を開始した。そのため、まず、IE1のＮ末端にGFP、Ｃ末端にHaloタグを介してTMRを結合させて分子内FRETの計測を行った。その結果、非感染細胞内とvirogenic stroma（VS）内ではFRET値に違いが認められ、LLPS形成に伴って、IE1は構造変化することが明らかとなった。そこで、現在、IE1を3分割ないしはIDRを含めて4分割し、それぞれのドメインの相互作用を解析中である。また今後は、光遺伝学的アプローチを使って効率的にLLPSを引き起こす遺伝子セットを同定し、最終的には、それらの遺伝子セットを持つ安定発現細胞株を作製して光誘導型の効率的な遺伝子発現系を構築する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
29年度は申請書の計画にしたがって、シャットオフ誘導遺伝子同定のためのRNAiスクリーニング系の確立を進めた。30年度も当初、BmN4-SID1細胞を使ってのRNAi実験を開始していたが、その間に新たな知見として、細胞の転写にliquid-liquid phase separation（LLPS）が重要な役割を果たしていることが次々と報告され（Science [2018] 361: 378. Science [2018] 361: 379. Science [2018] 361: 412-415. Cell [2018] 175: 1842-1855）、本研究の中心課題であるウイルスによる宿主細胞のシャットオフ機構の解明にもLLPS との関連からのアプローチが必要となった。すなわち、バキュロウイルスの転写はvirogenic stroma（VS）と呼ばれるウイルスが誘導する核内構造体で進行し、このVSもLLPSによって構造維持されていると考えられる。従って、ウイルス感染によるVS及びもう一つのウイルス誘導核内構造体peristromal region（PR）のLLPSが、細胞内のその他のLLPSに大きく影響し、これがシャットオフ機構と関連している可能性が高くなってきた。LLPSには天然変性領域（IDR）間の相互作用が重要であることが明らかになっているので30年度は、40残基以上のIDRを持つバキュロウイルスタンパク質18種のうち、VSあるいはPR局在が既に分かっているタンパク質のIDRを中心に解析を進めた。その結果、IE1によるLLPS形成には、IE1の構造変化が深く関わっている可能性が推測された。そこで、令和元年度にはIE1の構造変化の詳細な解析を開始した。以上のように、当初の計画とは異なるアプローチが必要となったため、進捗が遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後も、ウイルスが誘導するLLPSが、宿主細胞のシャットオフに関与しているという仮説に基づいて、LLPSの解析を進める。具体的には、様々なウイルス遺伝子のORF全体やIDR部分と、Arabidopsis thalianaの cryptochrome 2 (CRY2)およびCIBN遺伝子を融合したキメラ遺伝子を作製し、効率的にLLPSを引き起こす遺伝子セットを検討する。その結果、効率的なLLPS誘導が可能となったのちは、LLPSとシャットオフとの関係を明らかにする。そして、最終的には、それらの遺伝子セットを持つ安定発現細胞株を作製し、光誘導型の効率的な遺伝子発現系を構築する。
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| Causes of Carryover |
研究期間中、LLPSがシャットオフ機構と関連している可能性が高くなってきたため、研究方法を変更した。そのために計画実施が遅れ、次年度使用額が生じたが、次年度は研究を加速して、次年度の請求額と併せて、分子生物学用のキット類を含む薬品や細胞培養に必要なピペットやフラスコなどのプラスチック器具などを購入する予定である。
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