2020 Fiscal Year Research-status Report

昆虫細胞によるバキュロウイルス非依存型高効率タンパク質発現系の構築

Research Project

Project/Area Number	17K08162
Research Institution	Institute of Physical and Chemical Research
Principal Investigator	永峰俊弘国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 専任研究員 (90237553)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2022-03-31
Keywords	バキュロウイルス
Outline of Annual Research Achievements	本研究は、ウイルスによる宿主細胞のシャットオフ機構を利用して、昆虫細胞によるバキュロウイルス非依存型高効率タンパク質発現系を構築することを目的としている。当初は、RNAiスクリーニングによるシャットオフ誘導遺伝子の同定を進めていたが、研究期間中、細胞の転写にliquid-liquid phase separation（LLPS）が重要な役割を果たしていることが明らかとなり、本研究の中心課題であるウイルスによる宿主細胞のシャットオフ機構の解明にもLLPS との関連からのアプローチが必要となってきた。そこで、LLPSであるvirogenic stroma（VS）形成に中心的な役割を果たしているIE1の詳細な解析が、宿主細胞のシャットオフ機構の解明に必須であると判断し、IE1を3分割して、IE1の構造とLLPSの関連について解析を開始した。hr配列と呼ばれるウイルスDNA領域に結合し、IE1の点状構造（LLPS）形成に必要なBDI領域はIドメインのN末端に存在する。そのBDIを欠損させた変異IE1は、野生型同様、核に局在できることが明らかとなった。その一方、BDIのすぐ近傍に存在するKRK配列を欠損させると、その変異IE1は核に局在できなかった。しかし、KRK配列だけでは核局在シグナルとして機能できないことから、現在IE1の核局在に必要十分な配列を調査中である。また、BDI同様、核局在あるいはDNA結合に重要であると考えられているBDII領域はCドメインに存在する。Cドメイン単独では核に局在できるが、I＆Cドメインは核に局在できないことが判明し、構造依存的な局在機構の存在が明らかとなってきた。今後は、宿主細胞のシャットオフ機構に関連するVS様LLPSを引き起こすウイルス遺伝子セットを持つ安定発現細胞株を作製して、光遺伝学を使って、光誘導型の効率的な遺伝子発現系を構築する。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason 平成29年度は申請書の計画にしたがって、シャットオフ誘導遺伝子同定のためのRNAiスクリーニング系の確立を進めた。30年度も当初、BmN4-SID1細胞を使ってのRNAi実験を開始していたが、その間に新たな知見として、細胞の転写にliquid-liquid phase separation（LLPS）が重要な役割を果たしていることが次々と報告され（Science [2018] 361: 378. Science [2018] 361: 379. Science [2018] 361: 412-415. Cell [2018] 175: 1842-1855）、本研究の中心課題であるウイルスによる宿主細胞のシャットオフ機構の解明にもLLPS との関連からのアプローチが必要となった。すなわち、バキュロウイルスの転写はvirogenic stroma（VS）と呼ばれるウイルスが誘導する核内構造体で進行し、このVSもLLPSによって構造維持されている。従って、ウイルス感染によるVSの形成が、細胞内のその他のLLPSに大きく影響し、これがシャットオフ機構と関連している可能性が高くなってきた。そこで、令和元年度からは、VS形成に中心的な役割を果たしているIE1の局在機構及び構造変化の詳細な解析を開始した。以上のように、当初の計画とは異なるアプローチが必要となったことに加え、令和２年度は新型コロナウイルスの影響で実験を十分に行うことができなかったために進捗が遅れている。
Strategy for Future Research Activity	今後も、ウイルスが誘導するLLPSが、宿主細胞のシャットオフに関与しているという仮説に基づいて、VSの解析を進める。具体的には、IE1及びその他のVSタンパク質と、Arabidopsis thalianaの cryptochrome 2 (CRY2)およびCIBN遺伝子を融合したキメラ遺伝子を作製し、効率的にVS様LLPSを引き起こす遺伝子セットを同定する。効率的なLLPS誘導が可能となったのちは、LLPSとシャットオフとの関係を明らかにして、最終的には、それらの遺伝子セットを持つ安定発現細胞株を作製し、光誘導型の効率的な遺伝子発現系を構築する。
Causes of Carryover	研究期間中、LLPSがシャットオフ機構と関連している可能性が高くなってきたために研究方法を変更したことに加え、新型コロナウイルスの影響で実験を十分に行うことができなかったために計画実施が遅れ、次年度使用額が生じたが、次年度は研究を加速して、次年度の請求額と併せて、分子生物学用のキット類を含む薬品や細胞培養に必要なピペットやフラスコなどのプラスチック器具などを購入する予定である。