2021 Fiscal Year Annual Research Report
Construction of baculovirus-independent highly efficient protein expression system in insect cells
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17K08162
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
永峰 俊弘 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 専任研究員 (90237553)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | バキュロウイルス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、ウイルスによる宿主細胞のシャットオフ機構を利用して、昆虫細胞によるバキュロウイルス非依存型高効率タンパク質発現系を構築することを目的としている。当初は、RNAiスクリーニングによるシャットオフ誘導遺伝子の同定を進めていたが、研究期間中、細胞の転写にliquid-liquid phase separation（LLPS）が重要な役割を果たしていることが明らかとなり、本研究の中心課題であるウイルスによる宿主細胞のシャットオフ機構の解明にもLLPSとの関連からのアプローチが必要となってきた。そこで、LLPSであるvirogenic stroma（VS）形成に中心的な役割を果たしているIE1の構造とLLPSの関連について解析を開始した。hr配列と呼ばれるウイルスDNA領域に結合し、IE1の点状構造（LLPS）形成に必要なBDIb領域を欠損させた変異IE1は、野生型同様、核に局在できることが明らかとなった。その一方、BDIbのすぐ近傍に存在するBDIa(KRK)配列を欠損させると、その変異IE1は核に局在できなかった。しかし、KRK配列だけでは核局在シグナルとして機能できず、IE1の核局在にはBDIaとBDIbの両方が必要であることが明らかとなった。また、BDI同様、核局在あるいはDNA結合に重要であると考えられているBDII領域あるいはHLH領域を欠損すると、DNA結合能が失われてVSに局在できなくなることが分かった。更に、IE1及びその断片のFRETプローブを作製することによって、感染ステージに伴ったIE1の構造変化が明らかとなり、IE1がLLPS形成の重要なコンフォメーションスイッチであることが示唆された。
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