2017 Fiscal Year Research-status Report
| Project/Area Number |
17K08169
|
|---|
| Research Institution | Okayama University |
|---|
Principal Investigator |
金尾 忠芳 岡山大学, 環境生命科学研究科, 准教授 (40379813)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | 異化的硫黄代謝 / 無機硫黄化合物 / 硫黄酸化細菌 / 酵素化学 / 好酸性細菌 / 結晶構造解析 / refolding |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
鉄硫黄酸化細菌の一種 Acidithiobacillus ferrooxidans を研究の対象とし、硫黄化合物を代謝する酵素であるテトラチオン酸ハイドロラーゼ（4THase）について詳細な研究を行った。この4THaseは、無機硫黄化合物の加水分解反応を触媒し一部の好酸性微生物にのみ確認されている極めてユニークな酵素である。当該研究では既に、A. ferrooxidansの4THase遺伝子（Af-tth）を世界で初めて同定し、これを大腸菌組換え発現で得た封入体から酸性refolding処理により活性型酵素を獲得する新規な手法を開発し、必要十分量の酵素を獲得、結晶化にも成功した。
本研究にて得られたAf-Tth結晶をSPring-8を利用したX-線照射実験で1.75オングストロームの解像度で結晶構造データを回収することができた。本酵素は空間群（P32）格子定数（a=b=94.7, c=234.3）であった。さらに基質のテトラチオン酸を浸漬した結晶のX-線照射データの解析から本酵素の反応機構を推測した。Af-Tthは他の硫黄代謝関連酵素で見られるCys依存性の反応機構とは全く異なり、Asp325の基質へのプロトン供与による加水分解メカニズムであることを解明し、部位特異的変異酵素（D325N）の活性の消失からこれを証明した。
さらに海洋性硫黄酸化細菌SH株に検出された4THase活性から、本酵素の部分精製とこれをコードする遺伝子（SH-tth）の単離と組換え発現を行った。大腸菌組換え発現による封入体をAf-Tthと同様に酸性refolding処理により可溶性で活性型の組換えSH-Tthの獲得に成功した。本酵素は高濃度塩化ナトリウムで活性化されるなど海洋性細菌由来の特徴を示した。また、好酸性硫黄酸化微生物に分布する4THaseの多様性を示唆する興味深い性質を解明することができた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は、鉄硫黄酸化細菌Acidithiobacillus ferrooxidans由来の4THase（Af-Tth）の結晶構造解析と、これを基に反応メカニズムを解明することで、無機硫黄化合物の酵素化学という新たな学問分野を確立させることを目的として執り行っている。今回はAf-Tthの結晶に基質であるテトラチオン酸を浸漬させた結晶のX-線構造解析を行うことで、本酵素の活性中心とそれに関わるアミノ酸残基の特定を目指した。この結果、1.75オングストロームの解像度で基質と推定される電子密度の確認とそれに関与するD325残基を特定した。このD325の役割を解明するために作成した部位特異的変異酵素Af-Tth D325Nは活性が完全に消失したため、D325が活性に関与することを証明し、その反応メカニズムを解明することができた。これまで無機硫黄化合物を基質とした酵素は、ほとんど全てシステイン残基のチオール基が基質の硫黄原子と相互作用することによって反応することが報告されており、アスパラギン酸残基が関わる反応は極めて珍しい。その反応メカニズムは、基質のテトラチオン酸のalpha位の硫黄原子をアスパラギン酸残基がプロトン供与することで加水分解反応を触媒している反応モデルを確立した。
また、海洋性硫黄酸化細菌Acidithiobacillus sp. SH株由来の4THase（SH-Tth）についても分離・精製および遺伝子の同定と組換え発現、酸性refoldingによる活性型酵素の取得に成功した。これを利用して本酵素の生化学的性質を検討したところ、1MのNaClの存在下で2.5倍に活性化することが分かった。一方、淡水性細菌に由来する
Af-Tthの場合は同条件で極度に阻害されるため、この性質は海洋性細菌に由来する酵素の特徴を示した。本研究で4THaseの生化学的・生理学的多様性を示した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
H29年度は Af-Tthの加水分解反応の第一段階を解明することができた。H30年度は本結晶の構造解析をより詳細に推進することにより、他に類を見ない極めて特徴的な本酵素の反応メカニズムの全容解明を目指したい。Af-TthのX-線結晶構造解析により、まずは活性中心付近のアミノ酸残基について基質との相関関係をチェックする。そして、可能性の高いものについては部位特異的変異導入した変異酵素を作成し、活性への影響を観察する。その結果を基に反応メカニズムを推定する。
また、4THaseだけでなく、硫黄酸化細菌のその他の硫黄代謝関連酵素についても解析を推進する。ターゲットとしては、本菌の硫化水素酸化酵素、海洋性硫黄酸化細菌SH株に期待される新規なチオ硫酸脱水素酵素などがあげられる。まずはこれらの酵素を大腸菌組換え発現により活性型酵素を取得することを目指す。
|
| Causes of Carryover |
海洋性硫黄酸化細菌由来のSH-Tthについて、想定した以上の研究成果が得られたため、2018年度に開催される国際微生物硫黄代謝学会（オーストリア・ウィーン）への参加と成果発表するための旅費を捻出する必要があったため。
|
