2021 Fiscal Year Annual Research Report
Establishment of enzymatic chemistry (enzymology) of inorganic sulfur compounds and its applications
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17K08169
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
金尾 忠芳 岡山大学, 環境生命科学学域, 准教授 (40379813)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 無機硫黄化合物 / 硫黄代謝 / 硫黄酸化細菌 / 酵素化学 / 好酸性細菌 / 結晶構造解析 / 組換え発現 / refolding |
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| Outline of Annual Research Achievements |
鉄硫黄酸化細菌の一種 Acidithiobacillus ferrooxidans を研究の対象とし、硫黄化合物を代謝する酵素であるテトラチオン酸ハイドロラーゼ(4THase)について詳細な研究を行った。この4THaseは、無機硫黄化合物の加水分解反応を触媒し一部の好酸性微生物にのみ確認されている極めてユニークな酵素である。当該研究では既に、本菌の4THase遺伝子(Af-tth)の同定、組換え型酵素を結晶化し立体構造を決定した。さらに本酵素のユニークな反応メカニズムを解明するために、基質を浸漬した結晶構造解析を行うことにより、活性中心と反応に関わるアミノ酸残基の解析を行った。そしてD325がテトラチオン酸を加水分解するという、新規な反応メカニズムを解明した。さらにこの結晶構造解析から、D325の近傍に３つのメチオニン残基（M172, M238, M279）から成るメチオニンクラスターを発見し、これが硫黄原子を捕捉している様子を観察した。本研究課題においては、このメチオニンクラスターが本酵素活性にどの様に関わるのかを解明することに取り組み、最終的に反応メカニズムの完全解明を目指して研究を推進していく。一方で、Af-tth遺伝子がテトラチオン酸を生育基質とした場合に強く発現することから、この発現を担うプロモーターについても解析を行った。その結果、Af-tthの転写開始点とプロモーター領域を同定し、これを利用した本菌の組換え遺伝子発現ベクターを構築した。接合伝達による大腸菌とのシャトルベクターで、緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子を本プロモーターの支配下においたベクタープラスミドをA. ferrooxidansに導入し、テトラチオン酸を生育基質とした組換え菌株は、薬剤耐性を持ち緑色蛍光を示した。これによりGFPのA. ferrooxidansを宿主とした組換え発現に成功した。
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