2017 Fiscal Year Research-status Report
脱硫菌とPAH分解菌による芳香族縮合型複素環化合物分解マトリックス構築と環境浄化
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17K08173
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| Research Institution | Tokyo University of Technology |
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Principal Investigator |
松井 徹 東京工科大学, 応用生物学部, 教授 (90372812)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 有機硫黄化合物 / トランスポゾン / 酸性雨 / バイオ脱硫 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１．微生物分解経路の解析およびマトリックスの作成
微生物分解マトリックス化試験に先立ち、芳香族縮合型複素環化合物と環境汚染に関する文献調査を行い、検討基質として脱硫分解報告が少ないもの（チアンスレン(TH)）、脱硫分解報告がないもの（フェノキサチイン(PX)、フェノチアジン(PH)、スルファメトキサゾール(SMX)）を選抜した。研究室保存の各種有機硫黄化合物分解菌を用いて培養試験を行ったところ、DBT脱硫細菌R.erythropolis KA2-5-1はTH、PX、PHを唯一の硫黄源として生育した。さらに上記培養抽出液のGC-MS解析結果から、分解中間体の構造を推定した結果、スルホン化合物を経由するこれまで報告のない代謝経路によることを明らかにした。また、Gordonia sp. TM414株はTHを同様に分解することも明らかにした。
２．分解関連遺伝子の解析
上記分解特性の結果と分解遺伝子の関連を明らかにすることを目的に、KA2-5-1株由来の脱硫遺伝子群dszA, B, CをRhodococcus sp.を宿主として発現する各種発現ベクターを用いて評価した。その結果、KA2-5-1株において認められた分解基質をいずれも同じ分解経路で分解することが分かり、dsz遺伝子群が分解に関与していることが明らかとなった。
ベンゾチオフェン（BT）の硫黄分を選択的に酸化除去する能力（以下BT脱硫）のあるRhodococcus jostii T09株のBT脱硫遺伝子解明を目的に、T09遺伝子破壊株を構築するための基礎的検討を行った。トランスポゾンベクターの電気パルス法による検討の結果、生育培地および電圧が形質転換効率に大きな影響を及ぼすことが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
微生物分解経路の解析は、質量分析により中間代謝物の構造を速やかに明らかにすることができたため、学会発表を行った。形質転換効率が不明であったため、トランスポゾンベクターを用いた遺伝子破壊株構築が不確定要素であったが、順調に立ち上げることができ、条件の最適化によりライブラリー構築の目途が立った。
以上のことから、初年度計画事項に関しては概ね順調に進展していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．分解関連遺伝子解析－前年度に検討を開始した分解関連遺伝子解析を継続すると共に保存菌株プロモータの遺伝子解析を実施する。すなわち、微生物ライブラリーに含まれているPseudomonas putida HKT554の分解関連遺伝子であるナフタレンジオキシゲナーゼのプロモータ配列を明らかにする。
２．新規微生物の探索－微生物ライブラリーの拡充を目的として国内外環境試料からの各種芳香族縮合型複素環化合物分解菌の探索を高塩濃度条件下で実施することで新種微生物の取得をめざす。国内試料は沖縄、高尾山周辺の土壌試料を用い、国外試料はMOU契約を締結済みのチュニジアにて収集する。チュニジアでの試料収集はBorj-Cedria ecopark研究所環境分野助教Dr. Leila Ben Moussa El Bassi、准教授Dr. El Akrem Hayouniの協力のもとに行う。また、従来法にみられる炭素源としての分解菌の探索は行わず、培地に硫黄源フリー培地にDBTなどの有機硫黄化合物を唯一の硫黄源とする集積培養を行うことで新規微生物取得の可能性を高くする。文献調査から、酵母類にも脱硫分解活性の可能性があるため、酵母による分解検討を追加実施する。
３．微生物ライブラリーによる複合基質の分解－環境中での分解挙動を知るために、基質を混合し、上記分解マトリックスデータを元に選抜した分解微生物と複合基質の分解経過を解析する。各種基質の分解の優先順位、分解微生物を混合した場合の残存性と培地組成の関係を明らかにする。
４．芳香族縮合型複素環化合物（ACHC）分解速度の改良－前年度既に検討を開始している脱硫遺伝子群dsz発現ベクターによる組換え菌を用いた分解速度の改良を継続する。
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| Causes of Carryover |
学会発表を1回にまとめたため、当初予定の2学会参加が1学会に減少した。また、培養抽出物解析による代謝中間体の構造を速やかに決定できたため、分析関連経費が抑えられた。 次年度は、国際会議参加を含め、積極的に学会発表を実施すると共に、代謝中間体の構造決定を促進するために外注分析も検討していくこととする。
次年度使用計画（概算、単位円）学会参加（国内2名、2回)-200,000（計画通り）,学会参加（国外2名、1回)-600,000（計画増）,消耗品-1,950,000（計画通り）,合計2,750,000
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Research Products
(1 results)
