2017 Fiscal Year Research-status Report
Engineering a Chimeric Complex of Plant Enzymes to Improve Photosynthetic Production of Bio-ethylene by Cyanobacterium.
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17K08174
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| Research Institution | Meijo University |
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Principal Investigator |
神藤 定生 名城大学, 理工学部, 助教 (90583865)
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2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | エチレン / シアノバクテリア / 酵素複合体 / Synechococcus / コヘシン / ドックリン / ACC合成酵素 / ACC酸化酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題は、光合成細菌の光合成産物をバイオエチレンとして回収する研究である。さらに、嫌気性微生物のバイオマス分解系を模倣した酵素複合体化技術により、エチレン生合成酵素を光合成細菌で効率よく機能させる基盤技術の開発を行い、これを展開させた。
本年度では酵素複合体の酵素組成および酵素モル比の変更によるバイオエチレン生産の効率化を目的に新規キメラ骨格タンパク質Cip4の構築を行った。具体的には1ヶの1-アミノシクロプロパン-l-カルボン酸(ACC)合成酵素(ACS)、1ヶのメチルチオアデノシン(MTA)分解酵素(MTAN)および2ヶのACC酸化酵素(ACO)を保持する骨格タンパク質であるところのCip4を構築した。次にこれを保持する発現ベクターを用いてSynechococcus elongatus PCC7942 (R2-Pc株)を形質転換させ、得られた組換え体をSOC4株とし、バイオエチレン生産量をガスクロマトグラフィーで定量した。結果、既存のSOC2株と比較して、2.4倍高いバイオエチレン生産量増加を示した。また、ウェスタンブロッティング解析の結果、ポリシストロニックmRNA中のCip4を含む各ORFのタンパク質発現を観察した。よって、酵素の組成およびモル比変更によるバイオエチレン生産効率の上昇理論値を得た。
いっぽう、バイオエチレン合成反応によって、宿主細菌から供給される基質S-アデノシルメチオニン(SAM)が不足すると考えられる。そこで、細胞内SAM供給量を増やすため、E. coli由来SAM合成酵素遺伝子をClostridium thermocellum typeII由来のドックリンと遺伝子工学的に連結しSAM-Docを新規に構築した。
以上より、光合成細菌で発現させたエチレン生合成酵素が複合体化によって効率よく機能し、二酸化炭素から光合成的にバイオエチレンを生産させる技術の確立が期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画通り、平成29年度においては、（1）コヘシンCjを1ヶ、コヘシンAcを2ヶ、コヘシンCtを1ヶ連結したキメラ軸タンパク質(Cip4)の新規構築と発現を行った。その結果、酵素複合体の酵素組成と酵素モル比を変更した新たな複合体を得た。しかし、Cip4の構築する際、コヘシンAcの繰り返し配列によるミスアニールによってプラスミドの構築が困難となった。そこで、人工遺伝子合成によるシアノバクテリア・大腸菌へのコドン最適化をコヘシンAcへ行い、繰り返し配列を除去し、これを用いてCip4を構築した。（2）SAM-Docの新規構築と発現を行った。当初計画ではS. elongatus由来SAMを用いる予定であったが、相同組換えによる欠損を考慮し、E. coli由来SAMを用いてSAM-Docを構築した。（3）CO2削減効果の定量化を目的に、二酸化炭素からエチレンへの物質変換効率を求めた。結果、酵素組成と酵素モル比が異なる、SOC3B株およびSOC3D株について、エチレン生産量とCO2固定化量の相関関係を明らかにした。 以上より、当初の計画通り、おおむね順調に進めていると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度は、（1）構築した酵素複合体(SOC4)を光合成細菌で発現させ、バイオエチレンの生産効率を測定する、また（2）単位時間当たりのバイオエチレン生産量増加を目的に、単位培養液当たりの光合成細菌密度を増やす、培養スケールを上げる、などの条件検討を行い光合成細菌の培養最適条件を確保する。さらに、これら酵素複合体シリーズを持つ光合成細菌の培養最適条件を検討し、より成果を上げるために精力的に研究を展開する。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた理由として、平成29年度の最終物品発注日を年度末に設定し、これによる支払い書類提出の遅れが生じたため、次年度使用額が0円を超えることとなった。平成30年度においては、年度末の物品発注を、より早い段階で行うこととする。
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[Journal Article] Complexity of the Ruminococcus flavefaciens FD-1 cellulosome reflects an expansion of family-related protein-protein interactions.2017
Author(s)
Israeli-Ruimy V, Bule P, Jindou S, Dassa B, Moras S, Borovok I, Barak Y, Slutzki M, Hamberg Y, Cardoso V, Alves VD, Najmudin S, White BA, Flint HJ, Gilbert HJ, Lamed R, Fontes CM, Bayer EA.
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Journal Title
Scientific Reports
Volume: 10
Pages: 1-15
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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