2017 Fiscal Year Research-status Report
糖鎖代謝関連酵素の遺伝子発現制御を通した植物遊離型糖鎖の機能解明と応用利用
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17K08197
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
木村 吉伸 岡山大学, 環境生命科学研究科, 教授 (70195387)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 遊離N-グリカン（FNG） / acidic PNGase / cytosolic PNGase / ENGase / 過剰発現 / 発現抑制 / Arabidopsis thaliana / Micro Tom |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本申請課題では，FNG生成に関与する酵素群の遺伝子発現制御を通して，① FNGの植物の分化・成長に関わる生理機能を実証するとともに，② その機能の植物成長（或いは果実熟成）制御への応用を目的とした基盤技術開発を目指している。本年度は，(1) FNG 生成に関与するaPNGase の過剰発現トマトについて，T4 世代の果実成熟促進を調査した。その結果，T2，T3世代で見られた果実成熟の昂進が観察されなかったため，T4世代果実のaPNGase 転写量解析，aPNGase 活性測定，複合型遊離糖鎖の構造解析を行った。その結果，転写量については顕著な変化は認められなかったが，aPNGase 活性の低下及び遊離糖鎖生成量の減少が確認され，転写後サプレッションが起こっていることが明らかになった。これらの結果は，aPNGase 活性あるいは遊離糖鎖が果実成熟促進に関与するという我々の仮説の傍証となった。(2) PNGase 遺伝子の発現を完全抑制した Arabidopsis thaliana の構築を完了した。表現型については野生型植物と顕著な差異が認められなかったが，aPNGase 活性の消失にも関わらず植物複合型遊離糖鎖が生成することを見出し，遊離糖鎖の生成に関わる新たな機構が存在することを証明した。(3) タンパク質品質管理系でFNG 生成に関与するcPNGase（１種）及びENGase（２種）それぞれのシングルノックアウト株から，２種酵素の二重欠損株（Arabidopsis thaliana）の構築に世界に先駆けて成功した。作出したcPNGas/ ENGase欠損株は野生株との間で表現型に大きな違いが観察されたことから，糖鎖遊離酵素あるいは遊離糖鎖が植物の分化・成長に重要な機能を有する可能性が明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
(1) トマトaPNGase Le遺伝子の過剰発現株（T4世代）について，T2世代，T3世代で観察されていた果実熟成促進が観察されなくなった結果を受けて，過剰発現させたaPNGase Leが継代育種により転写後サプレッションを受けていることを，酵素活性の低下，遊離糖鎖量の減少等から証明した。この結果は，aPNGase 活性あるいは遊離糖鎖が果実成熟促進に関与するという我々の仮説の傍証となった。この研究を通して新たなaPNGase 活性測定法を確立した。
(2) aPNGase 遺伝子の発現を完全抑制した Arabidopsis thaliana の構築を証明し，aPNGase 活性の消失にも関わらず植物複合型遊離糖鎖が生成することを見出し，遊離糖鎖の生成に関わる新たな機構が存在することを証明した。
(3) cPNGase/ENGase 二重欠損株（Arabidopsis thaliana）の構築に世界に先駆けて成功した。表現型に大きな違いが見られ，糖鎖遊離酵素あるいは遊離糖鎖が，植物の分化・成長に重要な機能を有する可能性を示した。
(4) 植物複合型糖鎖の代謝分解に関わる トマトα-Fuc'ase の異種発現系構築に成功し，本酵素が植物複合型糖鎖に特徴的なα1-3Fuc残基をある特定の糖鎖構造から遊離させることを明らかにした。この結果は，植物複合型糖鎖の代謝分解経路には数種グリコシダーゼの一定の作用順序が存在することを示したものである
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| Strategy for Future Research Activity |
(1) 過剰発現させたaPNGase Leが継代育種により転写後サプレッションを受けていることが明らかになったことから，遊離N-グリカンの果実成熟促進活性が支持された。そこで，遊離N-グリカンの受容体の探索を行う。細胞膜での存在が推定されているlegume型レクチン様レセプターキナーゼに焦点を当て遺伝子同定及び異種発現系構築を目指す。
(2) cPNGase/ENGase 二重欠損株（Arabidopsis thaliana）の構築に世界に先駆けて成功したので，その変異体について詳細な表現型解析，生成遊離糖鎖の構造同定を行うとともに，両遺伝子のノックインを行うことで表現型の回復を確認する。これらの糖鎖遊離酵素はタンパク質品質管理系に関与しているので，二重欠損がERAD 機構に及ぼす影響を解析する。
(3) cPNGase/ENGase 遺伝子についても，aPNGase と同様に過剰発現植物（トマト，A.thaliana）の構築を行うことで，遊離N-グリカンの生理機能解析を継続する。３種遺伝子の過剰発現構築には，ゲノム編集技術によるノックインを行う計画である。
(4) 遊離N-グリカンの分解に関与するβ-Xyl'ase及びα-Fuc'ase 遺伝子についても，発現制御植物の構築を開始する。
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| Causes of Carryover |
物品費において，機器部品（HPLC カラムの一部，蛍光ランプ，紫外線ランプ交換等）を別予算で購入したため，科研費での購入の必要がなくなった。
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