Functional analysis of plant free oligosaccharides through regulation of gene-expressions of oligosaccharide-related enzymes and application of the biological functions

2019 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17K08197
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 木村 吉伸 岡山大学, 環境生命科学研究科, 教授 (70195387)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 遊離N-グリカン / ERAD / PNGase / ENGase / 発現制御 / 過剰発現

Outline of Annual Research Achievements

分化成長中の植物組織には，遊離N-グリカン（ FNG）がμM濃度で存在する。本申請課題では，FNG生成に関与する酵素群の遺伝子発現制御（抑制と過剰発現）の構築することにより， ① FNGの植物の分化・成長に関わる生理機能を実証するとともに，② FNG 機能を植物成長制御へ応用するための基盤技術開発を行うことを目的としている。
2019年度は，糖鎖遊離酵素であるaPNGase 遺伝の過剰発現トマト（T2世代）において果実成熟の促進現象とFNGs量の増加を確認した。しかしながら，T4世代では熟成促進現象とFNGs量の増加は見られなくなり，過剰発現遺伝子のサイレンシングが起こった可能性が考えられた。本研究過程で，植物抽出液中のaPNGase活性の新たな検出方法を確立し，変異体植物のPNGase活性を迅速に測定することが可能になった。一方，糖鎖遊離酵素の遺伝子抑制については，A.thaliana を用いて，cPNGase/ENGase DKO（遺伝子的にはTKO）株を構築した。その結果，タンパク質品質管理系で機能する２種糖鎖遊離酵素の遺伝子抑制によっても，構造特性は異なるものの，GN2型FNGsの生成が見られたことより，ER中でのオリゴ糖-脂質中間体からポリペプチド鎖へのOSTによるオリゴ糖転移反応においてFNGsが生成していることが示唆された。更に，ERADに関係する４種のタンパク質 (ER-Man’ase, OS9, HARD1/2, Sel1) の変異株 (A.thaliana) において，FNGsの構造特性を解析した結果，それぞれの株でFNGsの構造特性あるいは生成量に違いが認められ，ERADに破綻を来した場合にはオートファジー系がFNGs 生成に関与することが示唆された。更に，FNGsに特異的なレセプターを精製するために新たな人工糖鎖ポリマーの合成に成功した。

Research Products

• [Int'l Joint Research] ゲント大学(ベルギー)
  • Country Name: BELGIUM
  • Counterpart Institution: ゲント大学
• [Int'l Joint Research] ウィーン大学(オーストリア)
  • Country Name: AUSTRIA
  • Counterpart Institution: ウィーン大学
• [Journal Article] Synthesis and Preliminary Evaluation of a Neoglycopolymer Carrying Multivalent N-glycopeptide Units (2020)
  • Author(s): Takeda, N., Maeda, M.,Itano, S.,Takase, M.,Kimura, M.,and Kimura, Y.
  • Journal Title: International Journal of Biological Macromolecules Volume: 147 Pages: 1294-1300
  • DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2019.09.255
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Plant Complex Type Free N-glycans Occur in Tomato Xylem Sap. (2019)
  • Author(s): Tsujimori, Y., Ogura, M., Rahman, MZ., Maeda, M.,and Kimura, Y
  • Journal Title: Biosci Biotechnol Biochem. Volume: 83 Pages: 1310-1314
  • DOI: doi.org/10.1080/09168451.2019.1608803
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Convenient Preparation of an Antigenic Oligosaccharide from White Kidney Bean Powder： A Useful Plant Oligosaccharide for Synthesis of Immunoactive Glycopolymer. (2019)
  • Author(s): Kimura, M., Ogura, M., Akamatsu, M., Sugimoto, K., Maeda, M., Nitoda, T., Nagasawa-Fujimori, H., Yamashita, H., and Kimura, Y.
  • Journal Title: International Journal of Biological Macromolecules Volume: 148 Pages: -
  • DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2019.10.231
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Analysis of aPNGase-overexpressed tomato line (T2 generation): phenotype, PNGase activity and structural features of FNGs (2019)
  • Author(s): Yamamoto, C., Ogura, M., Matsumaru, C., Maeda, M., Kimura, Y
  • Journal Title: Glycoconjugate Journal Volume: 36 Pages: 379
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structural features of high-mannose type free N-glycans (FNGs) in A. thaliana mutant lines lacking in ERAD related proteins (2019)
  • Author(s): Furuta，K., Maeda，M., 1, Strasser, R., and Kimura, Y
  • Journal Title: Glycoconjugate Journal Volume: 36 Pages: 241
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Structural Features of FNGs and Salt Sensitivity of ENGase and ENGase/cPNGase knockout Arabidopsis thaliana (2019)
  • Author(s): Shirai, S., Uemura, R., Maeda, M., Misaki,R.,Fujiyama, K., and Kimura, Y.
  • Journal Title: Glycoconjugate Journal Volume: 36 Pages: 379
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 新規人工糖鎖ポリマーによる植物複合型糖鎖結合タンパク質のスクリーニング (2020)
  • Author(s): 田中創平，前田恵，木村吉伸
  • Organizer: 日本農芸化学会中四国支部第５６回講演会
• [Presentation] 緑藻ミル Codium fragile 由来レクチン (CFL) のホモオリゴマー構造について (2020)
  • Author(s): 八塚真悟，前田恵，木村吉伸
  • Organizer: 日本農芸化学会中四国支部第５６回講演会
• [Presentation] 免疫活性測定を目的としたイモ類に含まれる貯蔵タンパク質の糖鎖構造解析 (2020)
  • Author(s): 蓮井泉保，木村吉伸，前田恵
  • Organizer: 日本農芸化学会中四国支部第５６回講演会
• [Presentation] 大腸菌 BL21(DE3)を用いたα-synuclein(AS)の多量発現と新たな精製法の確立 (2020)
  • Author(s): 小坂将太，前田恵，木村吉伸
  • Organizer: 日本農芸化学会中四国支部第５６回講演会
• [Presentation] Structural Features of FNGs and Salt Sensitivity of ENGase and ENGase/cPNGase knockout Arabidopsis thaliana (2019)
  • Author(s): Shirai, S., Uemura, R., Maeda, M., Misaki,R.,Fujiyama, K., and Kimura, Y.
  • Organizer: 25th Internatuonal Symposium on Glycoconjugates, Milano, Italia
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Analysis of aPNGase-overexpressed tomato line (T2 generation): phenotype, PNGase activity and structural features of FNGs (2019)
  • Author(s): Yamamoto, C., Ogura, M., Matsumaru, C., Maeda, M., Kimura, Y
  • Organizer: 25th Internatuonal Symposium on Glycoconjugates, Milano, Italia
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Structural features of high-mannose type free N-glycans (FNGs) in A. thaliana mutant lines lacking in ERAD related proteins (2019)
  • Author(s): Furuta，K., Maeda，M., 1, Strasser, R., and Kimura, Y
  • Organizer: 25th Internatuonal Symposium on Glycoconjugates, Milano, Italia
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Analysis of suppressive function of dendritic cells by glycopolymers carrying multivalent plant antigenic N-glycans beraing Lewis a epitope (2019)
  • Author(s): Maeda，M., Tanabe, C., Tani, M., and Kimura, Y
  • Organizer: 25th Internatuonal Symposium on Glycoconjugates, Milano, Italia
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Molcular characterization of peanut β-xylosidase active towards plant specific antigenic N-glycans (2019)
  • Author(s): Md Asaduzzaman, Maeda, M., and Kimura, Y
  • Organizer: 第92回日本生化学会大会