2018 Fiscal Year Research-status Report
Development of functional recognition molecules for oxidized nucleosides in a cell
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17K08212
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| Research Institution | Showa Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
渕 靖史 昭和薬科大学, 薬学部, 特任助教 (40748795)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 分子認識 / 捕捉分子 / 8位酸化グアノシン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では細胞中で生成する様々な8位酸化グアノシン誘導体を標的とした、機能性認識分子の開発を目的としている。平成30年度は申請者がこれまでに開発したモデル分子nitroG-Grasp及び8-thioG-Graspの水中での反応性向上のための修飾を主に行った。nitroG-Grasp誘導体は、本研究の標的ヌクレオシドの一種である8-nitro-cGMPを水中で共有結合捕捉することを目指し、既に培養細胞を用いた評価系も予備的に行っている。実際にはまず平成29年度に報告した、ベンジルチオール基とグアニジノ基を導入したプローブ分子「NGG-H」について、より詳細な評価と新規誘導体の合成・評価を行った。NGG-Hは中性水溶液中においても、分子認識を介して効率的に8-nitro-cGMPを捕捉することに成功したが、反応開始後2時間で反応収率が30％程度で比較的反応性が低いことが示された。また捕捉して生成した化合物についても、各種機器測定により同定された。NGG-Hを利用した予備検討ではあるが、HEK293細胞を用いて細胞中に取り込まれた8-nitro-cGMPを捕捉することにも成功した。本分子を応用した新規誘導体「NGG-oMe」はベンジルチオールのベンゼン環部にメチル基を導入し、配向性制御による反応性向上を期待した設計である。NGG-oMeも合成し同様に評価したところ、反応開始後2時間で反応収率が60％程度まで顕著に反応性が向上した。さらにNGG-oMeのコントロール化合物としてNGG-pMeも合成・評価した結果、こちらの反応性はNGG-Hとほぼ同程度であったため、設計した通りの配向性制御効果が確かめられた。現在はNGG誘導体の反応速度論的解析と、培養細胞を用いた評価系を検討中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では4つの検討項目を計画しており、本年度までにそのうち3つがおおよそ完了しつつある。8-nitro-cGMPを標的としたnitroG-Grasp誘導体については生化学的検討へと展開中であり、当初の計画通りである。また8-thio-cGMPを標的としたプローブ開発のための基盤となる知見も得られたので、現在そちらも同時に検討中である。昨年度までに報告した、8-oxo-dGTPを検出するユーロピウム錯体分子も有用な成果が得られた。以上のように、現在までに本研究で開発している機能性認識分子については、新たな展開まで進めているので、順調に進展中であると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度に検討してきた本研究で設定した課題1) 「反応性を向上させたnitroG-Grasp誘導体の開発」については、シンプルな分子設計によって非常に反応性が高い捕捉分子NGG-oMeを開発することに成功した。この分子について速度論的解析を行うことで反応性向上の要因が活性化エンタルピー項、すなわち配向性制御によるものと立証された。今後は本分子を用いて培養細胞を用いた捕捉分子としての機能も検討中していく。NGG-Hを用いて培養細胞中に取り込まれた8-nitro-cGMPを捕捉していることを免疫蛍光染色によって観測したので、本評価系によってNGG-oMeについてもより効率的に捕捉しているか検討していく予定である。
また現在は本研究課題2)として設定した、8-thio-cGMPを認識し検出する蛍光プローブの開発も進めている。具体的なプローブの分子設計として、NGG誘導体の知見を基にグアニジノ基導入を適用し、さらに蛍光消光基としてニトロベンゼンスルホニル基を導入することとした。8-thio-cGMPとの分子認識による近接効果により、反応が促進されて消光基が脱離し、蛍光回復するTurn-on型プローブになることを期待した。現在プローブ前駆体までを合成することに成功し、各種スペクトル測定も行った。実際には消光基を有する誘導体は、持たないものと比較して10倍以上蛍光量子収率が低くなることが分かった。今後は有機溶媒中などで反応を行って蛍光プローブとしての有用性を確かめて、さらに様々な誘導体も合成・評価することで最適分子のスクリーニングを行っていく予定である。
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| Causes of Carryover |
申請者の異動に伴う必要資金として前年度に未使用分（約20万円分）を残余させておいたが、現所属研究室経費などにより大半を補うことが出来たため、本年度にも繰り越される形でその分の未使用額が生じたと考えられる。本年度は少々高額の生物評価系試薬等の購入も計画しているので、その補充として使用する予定である
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