2017 Fiscal Year Research-status Report
複数分子間の相互作用解析に基づく核内受容体ダイマー活性化の動的構造基盤
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17K08236
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
吉田 卓也 大阪大学, 薬学研究科, 准教授 (00294116)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 核内受容体 / NMR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
核内受容体は、代謝産物・ホルモン等に依存的な遺伝子の発現制御を担っており、生活習慣病やがんの創薬標的タンパク質である。しかし核内受容体の機能に重要とされるリガンド依存的な転写共役因子認識は、複数の分子が関与する複雑なプロセスであることから、その詳細には未だ不明な点がある。本研究ではその解明に寄与するため、複数分子間の相互作用を解析するための新たな実験系開発に取り組み、複数の転写共役因子との同時相互作用の観測および構造多形特異的な結合状態の評価を実現して、核内受容体の活性化の動的構造基盤を明らかにすることを計画している。
本年度はその準備段階として、NMRを用いた実験系を構築した。まず研究用試料として、PPAR,RXRなど複数の核内受容体のリガンド結合ドメイン試料の発現精製系を確立した。また、これらを用いて核内受容体PPARgamma/RXRalphaのリガンド結合ドメインからなるヘテロダイマーを調製した。さらに転写共役因子と核内受容体との結合を解析するため、転写共役因子に含まれる核内受容体認識配列のペプチドを金属イオンで標識したものを作成した。これらを用いて、リガンド依存的な核内受容体の構造変化、および複数の認識配列の結合をNMRにより解析できることを確認した。このように、今年度は研究目的である核内受容体ダイマー活性化における動的構造基盤の解明に向けて、基本的な実験系を構築し、その有効性を確認することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度はまず研究用試料の調製系を確立するため、核内受容体のうちPPARalpha,PPARgamma,RXRalphaのリガンド結合ドメインの15N/2H標識および13Cメチル化標識試料の調製系を作成した。また、これらを用いてPPARgamma/RXRalphaのリガンド結合ドメインからなるヘテロダイマーを調製した。リガンドを結合したヘテロダイマーを調製し、リガンド結合ドメイン間で、リガンドによるアロステリックな構造変化が起こることを確認した。複数の転写共役因子の結合を識別可能にするため、核内受容体認識配列ペプチドにキレート部位を導入し、ガドリニウムイオンを配位させたものを作成した。これらを用いて、複数の認識配列共存下で結合配列を解析できることを確認できた。この実験系において、リガンド非結合時においては、複数の転写共役因子ペプチドと核内受容体の結合は速い交換状態にある一方で、アゴニスト結合によりその交換状態が抑制され単一の結合コンフォメーションが選択されることが示された。このように、29年度の主な計画であるNMRを用いた実験系の確立は達成できたため、おおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまで構築した実験系を用い、複数の転写共役因子ペプチド共存下で、核内受容体およびそのヘテロダイマーとの相互作用を解析していく。また溶液中の核内受容体には構造多形が存在しているため、通常観測される結合定数は多形間で加重平均された値となっている。そこで今後は、各々の構造多形固有の転写共役因子との親和性を評価することを目指す。手法としてはNMR緩和解析を用いて、各状態の構造や占有率についての情報を得る。また同時相互作用の評価実験の結果を活用し、転写共役因子結合状態の構造や占有率についての情報を得る。これらの知見は変異体を用いて検証する。
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| Causes of Carryover |
今年度は研究の効率的な推進のためまず小スケールでの実験系の確立を優先した。そのため試料調製に用いる安定同位体試薬の使用量が予定より少なかった。その分を来年度スケールアップした実験のために購入し使用する計画である。
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Research Products
(1 results)
