2017 Fiscal Year Research-status Report
Fluorometric analysis of unstable phosphorylated biomolecules
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17K08237
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
小池 透 広島大学, 医歯薬保健学研究科(薬), 教授 (90186586)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | プロテオミクス / リン酸化分子 / 蛍光分析 / 亜鉛錯体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は，マイクロモル濃度のリン酸化生体分子を，生理条件下で選択的に捕捉する低分子亜鉛錯体化合物を用いて，生体機能制御を担う不安定なリン酸化シグナル分子の蛍光分析法の開発を目的とする。その研究手法は，現在汎用されているリン酸化シグナルの分析法と比較して，高精度かつ極めて短時間で定量解析することを可能にし，簡便な操作性や安全性などの利点をもち，癌やアルツハイマーなどの治療薬や次世代の抗菌薬の開発に役立つオリジナルな分析技術である。本年度は，可視光領域の蛍光分析が可能なテトラメチルローダミン（TAMRA）をもつリン酸化分子捕捉機能を有する機能性分子を用いた２種類の蛍光分析法の開発に成功した。１）アルカリホスファターゼ（ALP）は，リン酸化合物の加水分解反応やリン酸基転移反応を促進する生体内機能性分子である。本研究では，ピロリン酸を基質とするALP活性の新規蛍光分析法を開発した。リアルタイム分析では，初期蛍光強度変化よりALP濃度に依存した加水分解速度の増加を確認できた。また，ALPアイソザイム分析では，活性阻害評価によるアイソザイム特異性の分析にも有用であることを明らかにした。２）リン酸化アスパラギン酸含有不安定リン酸化タンパク質の電気泳動では，泳動後の染色などの処理によりリン酸基が加水分解除去される問題がある。本研究では，生理pH条件下数時間程度でリン酸化タンパク質の蛍光染色を可能にする手法を開発した。その手法は，蛍光染色分子としてTAMRA－Phos-tagを使用し，染色と脱色の２つの操作をそれぞれ１時間で行うことが可能であり，10μg以上のリン酸化タンパク質を選択的に定量分析することができる。次年度は，実用化に向けて必要となる実施例の作成を進めるとともに他の蛍光発色団についても検討する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
当初の研究計画にしたがって，問題なく順調に研究成果が得られており，学内外でその研究成果を発表している。さらに，電気泳動ゲル内の不安定リン酸化タンパク質のオリジナルな蛍光染色法の開発にも成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究計画の変更は全くありませんが，本研究過程で見出したセレンディピティ的な研究成果に基づいた新しい蛍光分析法の検討も並行して進めて行きたいと思います。本年度に開発した２つのオリジナルな研究手法については実用的なものとして世界中の先端装薬研究現場に届けられることを目ざし，産学連携について模索していきたいと考えています。
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| Causes of Carryover |
購入したい消耗品の金額以下の予算残高になったため，次年度予算として利用を希望しました。
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