2019 Fiscal Year Annual Research Report
Fluorometric analysis of unstable phosphorylated biomolecules
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17K08237
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
小池 透 広島大学, 医系科学研究科(薬), 教授 (90186586)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | タンパク質のリン酸化 / 蛍光分析法 / Phos-tag技術 / 二成分伝達系 / プロテオミクス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は，マイクロモル濃度以下のリン酸化生体分子を生理条件下で選択的に捕捉する低分子亜鉛錯体化合物（Phos-tag誘導体）を用いて，生体機能制御を担う不安定なリン酸化シグナル分子の蛍光分析法の開発を目的としている。その研究手法は，現在汎用されているリン酸化シグナルの分析法（放射性同位体法やリン酸化タンパク質に結合する抗体を用いる方法）と比較して，高精度かつ迅速な定量解析を可能にし，簡便な操作性や安全性などの利点をもち，癌やアルツハイマーなどの治療薬や，次世代の抗菌薬の開発に役立つオリジナルな分析技術である。本年度（最終年度）は，昨年度合成した，新規Phos-tag誘導体として開発した３種類のリン酸基選択的蛍光試薬を用い，実用的な不安定リン酸化種の蛍光分析方法を開発した。
創薬で注目されている病原性微生物の環境応答に関連したヒスチジンリン酸化反応やその下流のアスパラギン酸リン酸化反応の迅速な検出を行うため，His/Asp-リン酸化タンパク質をメンブレン上に固定化した試料をPhos-tag蛍光試薬でリン酸基選択的に染色する分析プロトコルを作成した。この方法により，ヒスチジンキナーゼ系の阻害剤や遺伝子発現制御物質のシーズ探索が可能になると考えている。また，その手法は，マイクロプレートやマイクロビーズなどへの応用も可能であり，固相に蛍光性リン酸化ペプチド基質を固定化した分析試料を調製することにより，よりハイスループットな阻害剤のスクリーニングシステムへ展開できる。今後，このオリジナルな蛍光分析法を様々な不安定リン酸化基質を用いた新しいキナーゼ・フォスファターゼのプロファイリング法として活用することを検討していく予定である。
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