2017 Fiscal Year Research-status Report
Development of the novel assay method for chromatin modified enzymes and application to epigenetics analysis
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17K08239
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| Research Institution | Nagasaki International University |
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Principal Investigator |
椛島 力 長崎国際大学, 薬学部, 教授 (20274673)
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2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | エピジェネティクス / クロマチン / ヒストン / DNA / 修飾酵素 / メチル化 / アセチル化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、クロマチン修飾に重要な酵素群（ヒストンおよびDNA修飾酵素）の簡便で安価かつ特異性が高い新規測定方法を開発し、本測定法をエピジェネティクス解析へ応用することを目的としている。エピジェネティクスは、DNAの塩基配列の変化（変異）なしにゲノム構造を変化させ、遺伝子発現を調節する制御機構を指す。エピジェネティクスは、胚発生や細胞の分化、老化、X染色体の不活性化など様々な生命現象と関連しており、細菌から動物に至るまで広く存在し、生物にとって重要な制御機構である。さらに、エピジェネティクスは、がんなどの疾患との関連も指摘されており、実際に、関連酵素の阻害剤が臨床適応されている。
現在のクロマチン修飾酵素の測定法は、主に、次世代シークエンサーによるDNAメチル化領域の解析やヒストンの構造解析などを中心に行われている。一方、DNAやヒストンの修飾に関連した酵素群の解析は、主にRT-PCRや抗体による発現解析である。これらの測定法は、煩雑、特異性が低い、特殊な試薬や特別な機器が必要などの欠点を有している。そのため、これら酵素群の生体内での詳細な機能解析には、簡便で安価、特異的、高感度な活性測定法が必要であるが、要求を満たすような測定法は開発されていない。
そこで本研究では、簡便、安価で特異性の高い、ヒストン脱アセチル化／脱メチル化酵素の活性測定法の開発、DNAメチル化酵素の活性測定法の開発を目的としている。
当該年度では、目的とするDNAメチル化酵素の活性測定法がほぼ開発できた。本法は、制限酵素とFRETを組み合わせた測定法であるが、同様な測定法と比べてバックグランドを1/10-1/50に低下させることで、DNAメチル化酵素の高感度測定に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
目的とするDNAメチル化酵素の活性測定法が開発できた。また、ヒストン脱アセチル化/脱メチル化酵素の活性測定法については、基質ペプチドをビーズに固定化されることで、活性が測定できることを確認しており、現在、測定系の反応条件を検討中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
DNAメチル化酵素については、各種がん細胞や正常細胞を用いて、本測定法によって酵素活性が測定できるか調べ、生体試料への応用を試みる。同時に、がんの種類や細胞周期によって、どのような酵素活性の変動が起こるか解析するとともに、がん細胞中の酵素に対する阻害剤の効果を調べる。
ヒストン脱アセチル化/脱メチル化酵素については、引き続き測定法の開発を行う。基質ペプチドをビーズに固定化されることで、ヒストン脱アセチル化酵素の活性が測定できることを確認しているが、測定に長時間を必要としており、これは、測定系の反応条件を検討することで解決できると考えている。
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| Causes of Carryover |
当初検討していたペプチドを基質として使用する方法では酵素活性が測定できないことが判明し、ペプチドの購入費が当初予算より少なくなった。しかし、ペプチドをビーズに固定化することで、酵素活性が測定できることが判明したため、翌年度分として、ビーズに固定化したペプチドの作製費に使用する。
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