2018 Fiscal Year Research-status Report
一変異によるメタロ－β－ラクタマーゼの活性中心と構造に与える影響の物理化学的解析
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17K08240
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
山口 佳宏 熊本大学, 環境安全センター, 准教授 (10363524)
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2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 酵素 / 蛋白質 / 薬剤耐性菌 / 阻害剤 / 構造機能解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
メタロ-β-ラクタマーゼ(MBL)は、ほとんどすべてのβ-ラクタム剤を加水分解する酵素であり、この酵素を発現する細菌は薬剤耐性菌として、臨床の現場で問題となっている。MBLのIMP-1酵素は日本でよく単離されており、そのアミノ酸一変異体であるIMP-6酵素も日本で単離されている。IMP-6産生菌の問題点は、既存のMBL検出薬では偽陰性を示すことであり、本研究は一アミノ酸の変異によって阻害剤認識に与える影響を物理化学的手法を用いて解析することである。 IMP-6の大量発現と精製はできており、結晶化および構造解析もできている。
平成29年度はIMP-6とMBL検出薬との複合体の結晶化を行い、放射光施設でX線回折データの収集を行ったが、構造解析できるほどのデータを得ることができなかった。
平成30年度は、IMP-1とIMP-6の活性中心にある２つのZn(II)イオンの脱離速度を解析した。酵素にキレート剤を加え、キレート剤とZn(II)イオンを結合させ、酵素の残存活性を経時的に測定することで、活性中心からのZn(II)イオン脱離速度を解析することができる。その結果、IMP-1では１つめと２つめのZn(II)イオンが抜ける速度が違うことがわかっているが、IMP-6は２つ同時にZn(II)イオンが抜け、さらにIMP-1よりもZn(II)イオンの脱離速度が速いことがわかった。またIMP-1とIMP-6の溶液中の構造を比較するために、X線溶液散乱で解析した。その結果、両酵素の慣性半径Rgは同等であることがわかった。これらの結果から、IMP-6はIMP-1の一アミノ酸の変異体であるが、そのアミノ酸変異によって溶液構造には変化を与えず、Zn(II)イオンとの結合に影響を与えていることがわかった。このZn(II)イオンとの結合能の違いが、MBL検出薬との結合にも影響を与えることがわかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は、一アミノ酸変異によって、阻害剤結合に違いができる機構を物理化学的手法を用いて分子レベルで解明することを目的とする。本研究の標的酵素であるIMP-1とIMP-6は、大腸菌による大量発現および高純度精製法を確立しており、物理化学的手法を利用することができる状態である。IMP-1およびIMP-6において結晶構造、X線溶液散乱による構造解析、阻害剤によるIC50値測定、Zn(II)イオン脱離速度の解析による機能解析の比較ができており、一アミノ酸変異の影響を分子レベルで解明できるようになった。
そのため、本研究は順調に進んでいると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
IMP-1とIMP-6の構造機能解析による一アミノ酸変異による影響の解析では、Native構造の比較だけではその影響が解明できず、活性中心のZn(II)イオンの脱離を対象とした速度論的解析により、Zn(II)イオンの結合能に違いがあることがわかった。そのため、Zn(II)イオンの溶液中の挙動をCo(II)イオンに置換して分光学的に解析する。またIMP-1およびIMP-6とMBL阻害薬との複合体の結晶化を行い、結晶構造の解析を行う。これらにより、両酵素間のZn(II)イオンの結合能の違いの解析を分子レベルで行うことができる。
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