2017 Fiscal Year Research-status Report
LRRK2-Rab経路の理解に基づくパーキンソン病分子病態の解明
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17K08265
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
伊藤 弦太 東京大学, 大学院薬学系研究科, 特任講師 (10431892)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | パーキンソン病 / LRRK2 / キナーゼ / Rab / リン酸化 / 小胞輸送 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成29年度は、LRRK2によるRab10リン酸化の検出系を確立した。HEK293A細胞に野生型HA-
Rab10とY1699C変異型3xFLAG-LRRK2を共発現させ、恒常発現細胞を取得した。生理的条件に近いRab10の局在を検出するため、発現量が比較的低いクローン41-4を選択した。Phos-tag SDS-PAGEを用いてリン酸化のstoichiometryを検討したところ、発現しているRab10の約50%がリン酸化されていた。このリン酸化は、LRRK2特異的阻害剤で細胞を処理することで消失した。また、免疫細胞化学的解析によりリン酸化Rab10の細胞内局在を解析するため、リン酸化Rab10特異抗体を作製した。今後、免疫細胞化学的にリン酸化Rab10の局在などを解析する。
Rab10がリン酸化されたときに特異的に結合するタンパク質を探索するため、近傍に存在するタンパク質をビオチン化修飾するAPEX2タグを融合したRab10を発現する細胞を作製した。APEX2タグはbiotin phenolと過酸化水素が存在するとき、周囲40 nm程度に存在するチロシン側鎖をビオチン化する。作製した細胞のbiotin-phenolと過酸化水素で処理した後、固定してストレプトアビジン-Alexa488で染色したところ、両試薬存在時に特異的な染色が見られ、ビオチン化が生じたと考えられた。ビオチン化されたタンパク質を精製するため、ストレプトアビジンが結合した磁気ビーズを用いた。プルダウンされたタンパク質をストレプトアビジンHRPでイムノブロット解析し、ビオチン化タンパク質のプルダウンを確認した。今後、プルダウンされたタンパク質の質量分析による網羅的同定を試みる。
また、LRRK2分解制御因子の探索に向けて、LRRK2を恒常発現するU2-OS細胞株を作製した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初計画では、平成29年度には(1)Rabリン酸化の定量的検出系の確立、(2)LRRK2の分解制御因子の探索、(3)Rab結合タンパク質の探索、(4)小胞輸送アッセイの確立、(5)ヒト由来サンプルにおけるRabリン酸化の検出に向けた準備を進める予定だった。リン酸化Rab10特異抗体の完成により(1)(4)(5)の目処が立った。また、(2)LRRK2の分解制御因子の探索に用いるため、蛍光タンパク質を融合したLRRK2を恒常発現する細胞を作製し、LRRK2阻害剤処理時に分解を受けることを見出したことから、この点についてもスクリーニングに向けて順調に進展していると判断した。(3)Rab結合タンパク質の探索については、APEX-Rab10発現細胞を確立し、実際に近傍タンパク質のビオチン化が生じていること、ビオチン化されたタンパク質をプルダウンできることが確認できた。さらに、バックアップのための実験として、上記41-4細胞を用いて、パラホルムアルデヒドを用いて架橋した後にRab10を免疫沈降する実験系も確立した。このとき、Rab10を免疫沈降したのちにタグに対する抗体を用いてイムノブロット解析を行うと、Rab10がパラホルムアルデヒド処理依存的に高分子量側にスメア状に広がる様子が観察され、結合因子とのクロスリンクが生じていることが示唆された。これらの実験系を用いれば質量分析によりRab10のリン酸化依存的な結合因子を探索することができるため、この点に関しても順調に進展していると判断した。(5)に関しては、倫理申請の目処が立ったため、平成30年度にはヒトサンプルを用いた実験を開始することが可能と考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1)Rabリン酸化の定量的検出系の確立：作製したリン酸化Rab10特異抗体を検出抗体として用い、サンドイッチELISAにより過剰発現したHA-Rab10のリン酸化を定量的に検出する系を作製する。また、Rab10とLRRK2を過剰発現した細胞を96ウェルプレートに培養し、リン酸化Rab10特異抗体で蛍光免疫染色し、蛍光プレートリーダーでRab10リン酸化を定量的に検出する実験系も作製する。(2)LRRK2の分解制御因子の探索：tagBFP-LRRK2を恒常発現するU2-OS細胞をLRRK2阻害剤で処理したときに、LRRK2の分解をtagBFP蛍光強度の低下としてFACSで検出できるか検討する。また、同細胞をFACSを用いてソーティングできるか検討する。いずれも可能であれば、ゲノムワイドgRNAレンチウイルスライブラリーを同細胞に感染させ、ゲノム編集を起こした細胞プールをLRRK2阻害剤もしくはDMSOで処理する。FACSでtagBFP蛍光値を指標として、LRRK2阻害剤処理時に蛍光値の低下を起こさなくなったプールを回収し、gRNAの標的遺伝子を次世代シーケンサーにより同定する。(3)ビオチン化されたRab10近傍タンパク質を質量分析により網羅的に同定する。(4)41-4細胞に対してゲノムワイドsiRNAライブラリーをトランスフェクションし、リン酸化Rab10の局在に影響を与える遺伝子を網羅的に探索する。同定された遺伝子について、individual siRNAやCas9によるノックアウトにより一次スクリーニングの結果を検証する。(5)LRRK2遺伝子に変異をもつパーキンソン病患者から摘出された皮膚線維芽細胞を不死化する。内在性Rab10のリン酸化が上昇しているか否か検討する。
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