2018 Fiscal Year Research-status Report
H2S/活性イオウ分子と同産生酵素CBS/CTHの適応免疫と経口寛容における役割
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17K08287
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| Research Institution | Showa Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
赤星 軌征 昭和薬科大学, 薬学部, 講師 (70534551)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 高ホモシステイン血症 / シスタチオニン尿症 / 含硫アミノ酸代謝 / 硫化水素 / 適応免疫 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Cystathionine β-synthase (CBS) とCystathionine γ-lyase (CTH)はメチオニン代謝回路の中間産物ホモシステインからシステインを生合成する一連の酵素である。この経路の破綻は高ホモシステイン血症を招くが、CBS欠損が脳機能や全身性の重篤な症状を招き短命であるのに対し、CTH欠損は一見正常に見えるが様々な栄養的なストレスや投薬に対する潜在的なリスクを持つ。また両酵素は硫化水素産生酵素であるが、硫化水素産生酵素は他に3-mercaptopyruvate sulfurtransferase（MPST）が知られている。免疫疾患においても高ホモシステイン血症や硫化水素の産生不全が炎症を増悪化するが、免疫細胞での含硫アミノ酸代謝物の作用には不明点が多く、欠損のリスクは定まっていない。本件では我々が作成した長生きなCbs欠損マウス、Cth欠損マウスおよびMpst欠損マウスを用い、腸管免疫系と皮膚免疫系におけるCbs、CthおよびMpstの発現を確認し、これらの酵素の欠損マウスに対しハプテン誘導性腸炎、接触性皮膚炎およびI型アレルギーであるアナフィラキシーショックを惹起し、その炎症を評価する。それぞれの免疫系とその相関を含めた適応免疫の全体に対する含硫アミノ酸代謝異常の影響を個体レベルで解析する。本年度の研究では、全身性および皮膚アナフィラキシーモデルを試験し、皮膚免疫系で主にマスト細胞を主としたTh2細胞型の液性免疫優位な応答の惹起について比較解析した結果、CTH欠損マウスでは受動的皮膚アナフィラキシーに伴う炎症応答が減弱することが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度はCTH欠損マウスに対して全身及び皮膚における受動的アナフィラキシーを試験した。受動的皮膚アナフィラキシーモデル(Passive cutaneous anaphylaxis; PCA)は試験前日に抗2,4-Dinitrophenyl hapten is conjugated to Human Serum Albumin (DNP-HSA)IgEを耳介に皮下注射し、翌日にDNP-HAS抗原とEvans blue色素を静脈注射し、耳介皮膚へのEvans blueの血管透過性を評価した。その結果、Cth欠損マウスでは血管透過性が低下しており、皮膚における急性応答の減弱が認められた。受動的全身性アナフィラキシーモデル（Passive systemic anaphylaxis; PSA）は試験日前日に抗DNP-HSA IgEを静脈注射し、翌日にDNP-HSA抗原を投与し、直腸体温の低下を5分おきに2時間測定した。その結果、Cth欠損マウスで有意な変化は認められなかった。このため、皮膚の局所的な炎症応答ではCSE欠損の影響が見られると考えられた。またMpst欠損マウスをCRISPR-Cas9システムで新たに作成し、初期の遺伝学的解析や発現解析を行った。Mpst遺伝子はRhodanese活性を持つが、同じくRhodanaese活性を持ち、全身で広く発現しているThiosulfate sulfurtransferase (Tst)遺伝子が隣接しており、Tstの転写活性領域がMpst遺伝子領域に含まれていると考えられるため、Mpst活性とTst活性を評価する必要があったが、得られたMpst欠損マウスはMpst活性は欠損し、TST活性は正常であったため、今後炎症モデルを順次適用してくことが可能となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
Cth欠損マウスではPCAでは炎症応答の減弱が認められたが、PSAでは差異はなく、局所的な免疫応答か血管透過性に関連する調整機能に異常があると考えられた。PCAでの炎症応答では投与されたIgEを保持する皮膚マスト細胞から炎症応答が始まるので、Cth欠損マウスの骨髄マスト細胞を初代培養し、成熟させることで得られる結合組織型マスト細胞（皮膚マスト細胞に近いとされる）を使用して、IgE-抗原投与による脱顆粒応答に違いがあるか確認する。Cth欠損マウスでは全身的に酸化ストレスの原因となる高ホモシステイン血症、あるいは血管弛緩因子である硫化水素の産生不全などの免疫応答が変動する要因が考えられるため、Cth欠損マウスに負荷をかけて脆弱性の変化がないかを検討する。負荷としては高メチオニン食による高ホモシステイン血症の増強や低シスチン食による抗酸化物質の低減、あるいは絶食といった食事性の負荷と、硫化水素ドナーの投与を予定している。またCthとは異なりホモシステイン代謝には影響しないMpst欠損マウスでアナフィラキシー応答の変化があるか確認する。Mpstは肝臓、腎臓に多く発言するが、大腸やその他の臓器にも広く発現しているため、Mpst欠損でハプテン誘導性腸炎および皮膚炎モデルを試験する。
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| Causes of Carryover |
発注品と異なる物品が届いたために返金が発生したが、年度末であったため、次年度に繰り越して計画的に使用するほうが有意義であると判断した。
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Research Products
(3 results)
