2017 Fiscal Year Research-status Report
ノンジェノミックな新規レチノイン酸作用機構の解明とその応用研究
| Project/Area Number |
17K08292
|
|---|
| Research Institution | Hoshi University |
|---|
Principal Investigator |
高橋 典子 星薬科大学, 薬学部, 教授 (50277696)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
今井 正彦 星薬科大学, 薬学部, 助教 (40507670)
長谷川 晋也 星薬科大学, 薬学部, 助教 (60386349)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | レチノイン酸 / レチノイル化 / 蛋白質修飾 / シグナル伝達 / プロテインキナーゼA / ノンジェノミック |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
食物等から摂取する栄養素であるビタミンAは生体内で代謝され、活性型ビタミンA酸 (レチノイン酸、RA) を生成する。RAは細胞分化等の生命の維持に深く関わる重要な作用を示す。また、RAがヒト前骨髄性白血病細胞 (HL60細胞) を顆粒球様細胞に分化誘導させることから、現在急性前骨髄球性白血病患者の治療に使われている。RAの作用はRA核内受容体とRAの複合体による転写発現調節機構のみで説明されるが、この経路では説明できない事象が多く報告されている。RAの核内受容体を介さないノンジェノミックな作用機構として、RAが蛋白質と共有結合するレチノイル化反応 (RAによる蛋白質修飾) が見出され、プロテインキナーゼA (PKA)、G蛋白質制御因子、アクチニンがレチノイル化されることが明らかとなった。今年度はRAによるHL60細胞の分化誘導に伴うアクチニン蛋白質の変化について検討と核内PKA基質の同定を行った。先ず、未処理、RA処理したHL60細胞から調製した抽出画分中の蛋白質をMono Qカラムで分離しアクチニンの粗精製を行った。抗アクチニン抗体を用いて免疫染色を行い、溶出フラクションを特定した。その結果、未処理細胞アクチニンとRA処理細胞アクチニンは異なる位置に溶出した。次に、このアクチニン含有フラクションを用いて、抗アクチニン-1抗体と抗アクチニン-4抗体を用いて免疫沈降を行い抗RA抗体で検出した。使用した抗アクチニン-1抗体では免疫沈降できなかったが、免疫沈降したアクチニン-4は染色された。一方、核抽出画分中の蛋白質を二次元電気泳動により分離後、抗リン酸化-PKA基質抗体で免疫染色を行い、RA処理で新たに出現したリン酸化蛋白質をMSで同定を行った。現在、同定した蛋白質の抗体を用いて確認を行っている。以上、これらの結果は、レチノイル化、リン酸化といった蛋白質修飾が細胞分化に関わる可能性を示唆した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
二次元電気泳動を用いたPKA基質蛋白質とレチノイル化蛋白質の同定に時間と労力と費用を要しているが、現在のところほぼ計画通りに進んでいる。蛋白質を取り扱う研究は忍耐が必要であるが、辛抱強く実験を行い、着実に結果を出していきたい。
|
| Strategy for Future Research Activity |
新規のレチノイル化蛋白質とPKA によりリン酸化される蛋白質の同定を現在行っている。同定した蛋白質の修飾による機能変化、即ちその蛋白質における修飾の意味を解明しなければならない。先ず、レチノイル化PKAによる核内蛋白質のリン酸化へのRAの影響を詳細に調べ、核内蛋白質のレチノイル化の生体内意義を解明していく。また、PKAによりリン酸化される可能性のある核内候補蛋白質がPKAによりリン酸化されているかを、免疫染色法で検討する。さらに、遺伝子の発現調節に関わるヒストンのアセチル化、メチル化、ユビキチン化に及ぼす影響について解析し、RA受容体を介さないノンジェノミック制御機構を蛋白質修飾という観点から解明していく。また、蛋白質修飾を制御する因子を探索し、その医薬品としての可能性を検討する。
|
| Causes of Carryover |
当初平成29年度に計画していた実験の中で、核内レチノイル化PKAによりリン酸化される核内蛋白質の同定と新規レチノイル化蛋白質の同定は、核タンパク質を二次元電気泳動で分離し、蛋白質をSYPROで染色後、ブロッティング、免疫染色を行い、検出したタンパク質をに対しMALDI-QIT-TOFMS (MS) 解析を行う。この、Ms解析による同定が年度を跨ぐことになったため、また、学会での研究成果発表を平成30年度に行うこととしたため、これら経費を繰り越すこととなった。
|
Research Products
(20 results)
