2017 Fiscal Year Research-status Report

相互作用化合物に基づくベータバレル型チャネルＶＤＡＣの立体構造と機能の解明

Research Project

Project/Area Number	17K08296
Research Institution	Institute of Physical and Chemical Research
Principal Investigator	染谷友美国立研究開発法人理化学研究所, ライフサイエンス技術基盤研究センター, 上級研究員 (80450401)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	無細胞タンパク質合成 / チャネル / 相互作用化合物
Outline of Annual Research Achievements	本研究の目的は、ミトコンドリアのベータバレル型アニオンチャネルVDAC1/2/3それぞれの立体構造、特に、細胞死を抑制する相互作用化合物との複合体構造を解明することである。平成29年度は以下の研究を進めた。 (1)無細胞タンパク質合成法によるVDAC1/2/3の構造解析用高品質サンプル調製：本試料調製には、膜タンパク質に最適化した無細胞タンパク質合成系を利用した。特にVDAC3は複数のジスルフィド架橋を必要とし、酸化還元状態に応じてチャネル活性が変化することから、架橋に関与しないと考えられる複数のCysのうち２つをAlaに置換する変異体を作成し、一方のコンフォーメーションへの固定を試みた。ゲルろ過ピーク形状を指標に最適な変異の組み合わせを検索したが、安定性が大きく向上した変異体は確認されなかった。しかし、いずれの変異体とも比較的良好な性状を示したため、結晶化条件スクリーニングへ進めた。 (2)無細胞合成VDAC1/2/3の結晶化条件の検討：本年度は、VDAC1/2/3各単体の結晶化条件スクリーニングを行った。VDAC2とVDAC3については、変異体も含め、現段階では結晶が得られていない。 (3)無細胞合成VDAC1/2/3のクライオ電顕構造解析用サンプル調製：相互作用化合物の結合部位同定には、共結晶構造解析を第一の手法としているが、共結晶化などが困難な場合に備え、最近構造解析の主流となりつつ有るクライオ電子顕微鏡構造解析の併用を視野に入れ、今年度はクライオ電顕用サンプル調製条件検討を行った。 (4)結晶化促進に有効な抗体断片を取得するため、研究協力者のどどと協力し、VDAC1/2/3それぞれの一部領域を抗原としてラットを免疫し、モノクローナル抗体の作成を行っている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 単体の結晶化条件スクリーニングで良質結晶をまだ得ることができていないことから、やや遅れているとした。代わりに、当初計画に無かった結晶化促進用モノクローナル抗体取得を進めているため、抗体取得後には結晶化効率が改善することが期待される。
Strategy for Future Research Activity	平成30年度は、結晶化促進のため、VDAC1/2/3各タンパク質に特異的なモノクローナル抗体の取得とそれらの断片化を進め、抗体断片とVDAC1/2/3との複合体結晶化を行う。並行して相互作用化合物との共結晶化にも取りかかる。化合物の共存によってVDACのコンフォーメーションを固定できれば、結晶化促進効果も期待できる。また、クライオ電子顕微鏡用試料調製条件検討も引き続き行う。
Causes of Carryover	平成29年度に結晶を取得した場合に、その結晶測定のためのSPring-8や海外放射光施設への出張を行う予定だったが、良好な結晶を得るに至らなかったため、出張をしなかった。また、それらのデータの解析のために計算機端末を購入予定だったが、次年度以降に結晶測定に進んだ段階で最新の端末を購入するために、今年度は購入を控えた。