2019 Fiscal Year Research-status Report
相互作用化合物に基づくベータバレル型チャネルＶＤＡＣの立体構造と機能の解明
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17K08296
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
染谷 友美 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 上級研究員 (80450401)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 無細胞タンパク質合成 / チャネル / 相互作用化合物 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、ミトコンドリアのベータバレル型アニオンチャネルVDAC1/2/3それぞれの立体構造、特に、細胞死を抑制する相互作用化合物との複合体構造を解明することである。平成31年度は以下の研究を進めた。
(1) 結晶化促進および電子顕微鏡観察を容易にするために有効な抗体断片を取得するため、研究協力者のどどと協力し、昨年度にVDAC1/2/3それぞれの一部領域に対するモノクローナル抗体を作成した。リポソーム再構成VDAC1/2/3をそれぞれ用いた抗体スクリーニングにより、高親和性かつ立体構造認識抗体を生産する複数のハイブリドーマクローンを得た。今年度は、各ハイブリドーマから抗体可変領域遺伝子をクローニングし、構造解析に適した抗体断片（Fab, scFv等）の発現系作成を進め、複合体調製、安定性と性状の評価、複合体結晶化スクリーニングと電顕観察へ進めた。現在までに良好な結晶は得られていないが、抗体断片とVDACの組み合わせを変えて引き続き結晶化スクリーニングを行う。
(2) 平成30年度以降の計画として、共結晶構造解析が計画通りに進展しない場合にNMR構造解析を行う予定であったが、代わりに近年の有力な構造解析ツールであるクライオ電子顕微鏡を利用した構造解析を目指し、昨年度に引き続きクライオ電顕用サンプル調製条件検討を行っている。(1)の各種抗体断片とVDAC1/2/3を組み合わせたサンプルを脂質ディスクへ組み込み複合体のゲルろ過性状評価にて選別し、電顕観察へ進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
共結晶構造解析が計画通りに進展しない場合に行う計画であったNMR構造解析の代わりに、クライオ電子顕微鏡構造解析も行っているが、抗体断片との複合体の安定性に問題がある試料も多いことから調製条件検討に時間を要している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、安定複合体調製条件の調ったサンプルについて、残る共結晶化スクリーニングと電顕サンプルスクリーニングを完了させ、データ測定ができたサンプルについては構造解析を行う。
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| Causes of Carryover |
予定していた第二の解析法として、大量に試料が必要なNMRから、少量の試料でスクリーニングが可能な電子顕微鏡法へ変更したため、試料調製費用が予定より少額で済んだ。代わりに、クライオ電子顕微鏡単粒子解析による構造解析を開始すると高額な消耗品等が大量に必要となるため、解析用データ測定を始める予定の翌年度へ予算を繰り越した。
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[Journal Article] A distinct lineage of giant viruses brings a rhodopsin photosystem to unicellular marine predators2019
Author(s)
Needham DM, Yoshizawa S, Hosaka T, Poirier C, Choi CJ, Hehenberger E, Irwin NAT, Wilken S, Yung CM, Bachy C, Kurihara R, Nakajima Y, Kojima K, Kimura-Someya T, Leonard G, Malmstrom RR, Mende DR, Olson DK, Sudo Y, Sudek S, Richards TA, DeLong EF, Keeling PJ, Santoro AE, Shirouzu M, Iwasaki W, Worden AZ
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Journal Title
Proceedings of the National Academy of Sciences
Volume: 116
Pages: 20574～20583
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Metastable asymmetrical structure of a shaftless V1 motor2019
Author(s)
Maruyama Shintaro、Suzuki Kano、Imamura Motonori、Sasaki Hikaru、Matsunami Hideyuki、Mizutani Kenji、Saito Yasuko、Imai Fabiana L.、Ishizuka-Katsura Yoshiko、Kimura-Someya Tomomi、Shirouzu Mikako、Uchihashi Takayuki、Ando Toshio、Yamato Ichiro、Murata Takeshi
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Journal Title
Science Advances
Volume: 5
Pages: eaau8149
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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