Foundation of chemotherapy for malignant glioma targeting mTOR

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K08304
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 江田 岳誉 新潟大学, 医歯学総合病院, 薬剤師 (90772038)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 棗田 学 新潟大学, 脳研究所, 助教 (00515728)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: グリオーマ / mTOR / xenograft

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、膠芽腫に対する標準治療薬テモゾロミド(TMZ)の抗腫瘍効果を増強するための併用療法を確立することである。以下のテーマに分けて実験を行った。
1. 膠芽腫に対する新規化学療法剤の抽出：腫瘍細胞の増殖を抑制する物質を既存医薬品の中から探索した。3種の悪性グリオーマ細胞株(U251MG, T98G, LN229)において、cell viability assayを行い、既存薬の膠芽腫細胞に対する増殖抑制効果を調べた。なかでもリボソーム合成阻害作用を有する抗菌薬の一部から、上記すべての細胞株に対する濃度依存性の増殖抑制効果を確認した。さらにはTMZの併用により抗腫瘍効果が増強することも確認した。
2, mTORシグナルと腫瘍化、タンパク合成の必要性について：mTORはグルコースやアミノ酸などの栄養源を感知し、細胞の増殖および生存における調節因子の役割を担う分子である。mTORシグナルの過剰な活性化は、腫瘍化を引き起こす。上記実験から得た候補薬を同様の脳腫瘍細胞株にいくつかの濃度に振り分けて、アッセイを行うと新規タンパク合成が抑制されることを確認した。候補薬がmTORC1経路の活性を低下させることを示している。
3. 疾患脳とmTOR：上記in vitro の実験で得られた結果を生体内で再現することが目的である。そのためには生体内の環境を再現した実験系としてモデル動物を作成する必要がある。上記の脳腫瘍細胞株を免疫不全マウスの脳内に移植しxenograftモデルを作成した。移植後、この動物は四肢麻痺様の症状を呈し、活動量の低下などの異常が認められた。脳内では、移植した腫瘍細胞が髄内に留まり、移植部位から浸潤するかのように脳内に広がっていることを免疫染色で確認した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当該年度の到達目標であった悪性脳腫瘍の治療候補薬の抽出、in vitroにおける候補薬の薬効分析、評価まで実験が終了した。
「mTORシグナルと腫瘍化」では、候補薬とする抗菌薬の一部が、mTOR下流にあるp70S6 kinase、S6 kinaseのリン酸化を濃度・時間依存性に抑制し、新規タンパク合成を抑制することが判明した。これはmTORC1経路の活性を低下させることを意味し、腫瘍制御という観点からmTORC1が重要な作用点であることを示すことができた。悪性脳腫瘍の病態解明の手がかりになるものと考える
「疾患脳とmTOR」に関しては想定以上の進展があった。in vivo解析は、該当年度より以降の実験計画であったが、抗腫瘍薬としての候補薬を見いだし、in vitroにてその効果を早い段階で確認できたことで、予定を早めてxenograftモデルの作成を開始した。ヌードマウスを用いたT98G脳腫瘍細胞の脳内移植実験では、腫瘍が髄内にきちんと留って形成され、移植部位から浸潤するかのようにKi-67(clone: MIB-1)の発現が高くなっていることが脳組織の免疫染色により観察されている。また、この動物は四肢麻痺様の症状を呈し、活動量の低下も認めている。悪性グリオーマのモデル動物を確立しつつある。我々のグループではまた、実際の脳腫瘍患者から手術により摘出した脳腫瘍から、患者固有の脳腫瘍幹細胞株を樹立、その継代培養法を確立している。これにより個々の腫瘍モデルが得られ、腫瘍形成能の検討や各種薬物を用いて治療実験を行うことができる。

Strategy for Future Research Activity

既存の抗菌薬から抗脳腫瘍薬の候補となる薬剤を抽出できた。今後は遺伝子導入によりmTOR活性を調節した場合のタンパク合成系への影響を検討し、mTORシグナルと腫瘍化の詳細なメカニズムを明らかにし、新規治療法の開発につなげたい。
一方で今年度以降は、引き続きxenograftモデルの作成をすすめ、治療候補薬を脳腫瘍モデル動物へ投与する予定である。このモデルにおいて神経症状の改善や生存期間の延長が示されるなどの薬剤の治療効果が確認できれば、脳内におけるmTORシグナルにどのような生理的変化が起こったのかを分子生物学的に評価する。最終的には、このモデルの脳内では、mTOR下流のS6 kinaseのリン酸化がmTOR阻害薬により抑制され、結果としてmTORC1経路の不活性化により腫瘍の増大、進展が抑制されることを実験的に示すことができればと考えている。
30年度には原著2報の論文を投稿したい

Causes of Carryover

昨年度は細胞培養に必要な培養液やプラスチック器具、抗体などの消耗品を中心に物品購入した。そのため当該年度に購入予定であったcellcycle分析機器の購入を見送り、今年度に持ち越したため次年度使用額が生じた。