2018 Fiscal Year Research-status Report
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17K08321
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| Research Institution | Meijo University |
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Principal Investigator |
平松 正行 名城大学, 薬学部, 教授 (10189863)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
衣斐 大祐 名城大学, 薬学部, 准教授 (40757514)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ベタイン / アルツハイマー型認知症 / GABAトランスポーター２ / ホモシステイン / 3xTg-AD（3xTg）マウス / Neuro2A培養細胞 / 学習・記憶障害 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アルツハイマー型認知症（AD）患者では、脳内において産生されるアミロイドβ（Aβ）タンパク質の凝集・沈着による老人斑およびリン酸化tauタンパクの蓄積により引き起こされる神経原線維変化などにより神経細胞死が引き起こされる。しかし、現在、ADの根本治療方法はないため、発症を遅らせる予防的対策が求められている。
3xTg-AD（3xTg）マウスは、遺伝子改変技術によりAβ産生を増加させ、tauリン酸化を亢進させることで学習・記憶障害を誘発するADモデルマウスである。近年、認知症患者の血液中のホモシステイン（Hcy）量が健常者よりも高いこと、それら患者の認知機能と血液中Hcy量との間には負の相関があり、脳内の過剰なHcyは酸化ストレスなどを引き起こすことが報告されている。生体内におけるHcyは、ベタインによってメチオニンに変換される。我々は、すでに、3xTgマウスにベタインを慢性的に処置すると、学習・記憶障害発現が抑制されることを見出している。
そこで今年度、我々はベタインの作用メカニズムを調べるためにAβの活性化断片Aβ25-35をマウス脳由来Neuro2A培養細胞に処置したところ、コントロール群と比較して、顕著な細胞死およびベタインに対して親和性を示すGABAトランスポーター２（GAT2）の発現が増加することを見出した。一方、ベタインを前処置すると、Aβ25-35処置による細胞死およびGAT2発現増加が抑制された。次に、野生型（WT）および3xTgマウスの海馬におけるGAT2遺伝子の発現をin situ hybridization法により調べたところ、3xTgマウスの海馬において、GFAP陽性アストログリア細胞におけるGAT2発現の増加が確認できた。以上の結果より、ベタインによる学習・記憶障害発現抑制作用は、アストログリア細胞のGAT2を介して発現している可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度の研究では、Neuro2A細胞にAβ25-35を処置し、細胞毒性およびGAT2発現変化に対するベタインの作用および3xTgマウスの海馬におけるGAT2遺伝子発現を評価した。昨年度までは動物モデルのみの解析であったが、新たに培養細胞系実験を導入し、それに伴う研究結果も得ており、実験系は順調に進んでいる。
また、これまでに我々は組織学的にGAT2の発現を解析するためにGAT2に対するいくつかの抗体を購入し、免疫組織化学染色を試してきたが、我々の購入した抗体の中で有用なものはなかった。そこで我々は、組織学的にGAT2遺伝子を調べるためにin situ hybridization法を確立し、組織学的なGAT2遺伝子の染色に成功した。その結果、WTマウスと比較して3xTgマウスの海馬においてGFAP陽性アストログリア細胞におけるGAT2遺伝子の有意な発現増加を見出した。
以上の結果より、新たな実験系および手技の導入に成功し、それによる新たな実験結果が出てきており、おおむね順調に進展していると評価できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに我々は、Aβ25-35処置Neuro2A細胞で認められる細胞死およびGAT2発現増加がベタインの前処置により抑制されること、ADモデルの3xTgマウスの海馬におけるアストログリア細胞でGAT2の発現が増加すること、さらにベタインの慢性処置により3xTgで認められる学習・記憶障害の発現が抑制されることを明らかにしている。これらの結果からベタインが確かに神経保護的な作用を発揮していると考えられるが、その詳しい分子メカニズムは不明である。そこで、今後の研究の推進方策として、まずNeuro2A細胞を用いた実験では、GAT2阻害薬またはGAT2を安定的に過剰発現する安定発現細胞株を用いてAβ25－35処置による細胞死の変化を調べる。さらにマウスを用いた実験系では、3xTgマウスの海馬においてアデノ随伴ウィルス（AAV）によるGAT2のノックダウンまたは過剰発現が、ベタイン慢性投与による学習・記憶障害抑制作用に与える影響を調べる。以上の実験から、GAT2の病態生理学的意義とベタインの作用におけるGAT2の役割を明らかに出来ると考える。
次にGAT2を介して細胞に取り込まれたベタインが、どのようなシグナル経路に関与するか調べるために、網羅的な遺伝子発現をRNA-seqを行い調べていく。その後、発現変化した分子群からパスウェイ解析を行うことで、ベタインが細胞内でどのような分子と相互作用し、作用を示すかを調べていく予定である。
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| Causes of Carryover |
平成30年度までに得られた結果を基に、最終年度には本研究の集大成として、GAT2過剰発現またはノックダウンをアデノ随伴ウイルスを用いて行う。そのためにウィルス抽出・精製および遺伝子抽出・精製等に必要な消耗品とウィルス投与用のマイクロインジェクションユニットを購入予定である。さらにGAT2過剰発現またはノックダウンしたマウスを用いて作業記憶を調べるためにマウス用T-maze試験装置を購入する。研究結果をまとめて論文とするための英文校正および論文投稿費も必要となる。以上から、左の次年度使用額を最終年度の令和元年に使用する。
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