2017 Fiscal Year Research-status Report
Study in functional mechanism of neurodegenerative mediators
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17K08327
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| Research Institution | Himeji Dokkyo University |
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Principal Investigator |
矢上 達郎 姫路獨協大学, 薬学部, 教授 (00363812)
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2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 14-3-3 / 過酸化水素水 / cJUNキナーゼ / カスパーゼ / ユビキチン / プロテアソーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は、世界に先駆けて15デオキシ-デルタ12,14-プロスタグランジンJ2 (15d-PGJ2)を含むシクロペンテノン型プロスタグランジンを神経変性疾患メディエイターとして報告してきた。15d-PGJ2の神経細胞毒性に既知受容体は関与していなかった。我々は、神経細胞膜上に受容体とは異なる特異的結合部位を見出し、質量分析により15d-PGJ2膜標的タンパク質の網羅的同定に成功した。今回、15d-PGJ2膜標的タンパク質として同定した14-3-3ξの機能解析を行ったので報告する。ラット大脳皮質神経細胞において、14-3-3ξは細胞質ばかりでなく神経細胞膜表面にも局在していた。抗14-3-3ξ抗体によりH2O2が産生され、神経細胞死が誘導された。H2O2には神経細胞毒性が知られており、その下流にはMAPKが位置している。Jun amino-terminal kinases (JNK)阻害剤により抗14-3-3δ/ξ抗体の神経細胞毒性が有意に軽減された。一方、ERKおよびp38-MAPKの阻害剤では抑制効果は検出されなかったので、抗14-3-3ξ抗体による神経細胞死にJNKの関与が示唆された。また、その神経細胞死はカスパーゼ３の不活性化を伴っていたので、アポトーシスではないと考えられた。さらに、抗14-3-3ξ抗体はユビキチン化蛋白質の蓄積を抑制することを見出し、ユビキチンープロテアソーム系の亢進が示唆された。ユビキチン化蛋白質の蓄積増大が神経細胞変性に関与していることは知られているが、蓄積減少が神経細胞死にどのように関わっているのか不明である。カスパーゼ系抑制およびユビキチンープロテアソーム系亢進を伴う抗14-3-3ξ抗体による神経細胞死が、既知の神経細胞死に分類されうるのか、今後検討する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
アダプター蛋白質14-3-3は神経系組織に豊富に発現している。14-3-3ξは、他因子の分泌に関与していることは知られているが、14-3-3ξ自体の分泌機構については良く分かっていない。アミロイド斑と神経原線維変化はアルツハイマー病の２大所見として知られている。14-3-3ξは、アルツハイマー病において増加し、神経原線維濃縮体と共局在している。細胞質で14-3-3ξはタウタンパク質の過リン酸化を促進しているが、膜14-3-3ξは我々により最近見出されたばかりでその生理的および病理的役割は解明されていない。今回、細胞質14-3-3ξではなく膜14-3-3ξの機能を特異的に解析するために抗14-3-3ξ抗体が用いられた。抗14-3-3ξ抗体刺激により神経細胞死が惹起され、神経毒性が報告されている過酸化水素水産生を介している事が判明した。膜14-3-3ξは15d-PGJ2膜標的タンパク質の一つとして見出されたが、興味深いことにその細胞死惹起機構は15d-PGJ2の機構とは異なっていた。15d-PGJ2は、カスパーゼ３を活性化し、ユビキチンープロテアソーム系を抑制することが知られている。一方、抗14-3-3ξ抗体は、カスパーゼ３を抑制し、ユビキチンープロテアソーム系が活性化されていた。グルタチオン等のチオール系抗酸化剤は15d-PGJ2神経細胞毒性に対し保護効果を示すが、抗14-3-3ξ抗体神経細胞毒性に対しては示さなかった。一方、過酸化水素水を減らすカタラーゼは抗14-3-3ξ抗体神経細胞毒性に対し保護効果を示すが、15d-PGJ2神経細胞毒性に対しては示さなかった。15d-PGJ2によるアポトーシスが膜14-3-3ξを介している直接的証拠は得ることが出来なかったが、膜14-3-3ξ刺激による神経細胞死は既知の細胞死とは異なるのではないかと示唆される興味深い結果となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）我々の知る限り、中枢神経系において５つの細胞死が報告されている。プログラム細胞死としてアポトーシス、ピロプトーシス、フェロプトーシス、オートファジー様細胞死とネクロプトーシス、事故的細胞死としてネクローシスとオンコーシスが知られている。抗14-3-3ξ抗体による神経細胞死が新規か否かを調べるために、ATPの細胞内含量、カスパーゼ３以外のカスパーゼ、ユビキチンープロテアソーム系以外のタンパク質分解酵素（カルパイン・カテプシン等）、PI取り込み、クロマチン凝集、DNA断片化、形態変化等を指標に今後評価する予定である。
２）HSPA8は癌細胞表面に発現していることが知られている。我々は15d-PGJ2膜標的タンパク質の一つとしてHSPA8を既に報告している。脳卒中等で増加するHSPA8には神経細胞保護効果が知られているが、同様に増加する抗HSPA8抗体が神経細胞にどのような影響を与えうるのかは不明である。HSPA8が神経細胞の表面にも局在していることを見出しているので、15d-PGJ2によるアポトーシスが膜HSPA8を介しているのか否かを抗HSPA8抗体を用いて今後解析する。
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| Causes of Carryover |
当初，15d-PGJ2標的タンパク質として同定したPKM1, GAPDH, HSPA8, TCP-1α, 14-3-3ξの機能解析を行う予定であった。本年度は、主に14-3-3ξに集中して解析し、他の標的の解析が出来なかったため、未使用額が生じた。このため、次年度は14-3-3ξ以外の15d-PGJ2膜標的タンパク質についても機能解析を行い、また研究発表も行い、未使用額はその経費に充てることとしたい。
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