2019 Fiscal Year Research-status Report
Study in functional mechanism of neurodegenerative mediators
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17K08327
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| Research Institution | Himeji Dokkyo University |
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Principal Investigator |
矢上 達郎 姫路獨協大学, 薬学部, 教授 (00363812)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | プロスタグランジンJ2 / 大脳皮質神経細胞 / アポトーシス / VDAC / DIDS / PI取り込み / クロマチン凝集 / カスパーゼ３活性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は、15デオキシ-デルタ12,14-プロスタグランジンJ2 (15d-PGJ2)を含むシクロペンテノン型プロスタグランジンを神経変性疾患メディエイターとして報告してきた。15d-PGJ2の神経細胞毒性に既知受容体は関与しておらず、神経細胞膜上に受容体とは異なる15d-PGJ2膜標的タンパク質の網羅的同定に成功した。今回、我々は膜標的の一つとしてvoltage-dependent anion channel（VDAC）を見出したので、VDAC 阻害剤である4,4-diisothiocyanatostil-benedisulfonic acid (DIDS)を用いて15d-PGJ2の神経細胞毒性に対する効果を検討した。ラット大脳皮質神経細胞において、15d-PGJ2は、MTT還元活性を減少させ、PI取り込みを増加させ、クロマチンを凝集させ、カスパーゼ３を活性化し、アポトーシスを誘導した。15d-PGJ2存在下、DIDSを適用すると、保護効果よりむしろ促進効果が検出された。DIDS 100μM以上では単独でも神経細胞死を誘導した。DIDSは15d-PGJ2によるアポトーシスを亢進したが、単独では、PI取り込み、クロマチン凝集、カスパーゼ３活性にほとんど影響を与えなかった。これらの結果より、DIDSは単独ではアポトーシスを介さずに神経細胞死を誘導するが、15d-PGJ2によるアポトーシスに対しては促進作用を示すことが明らかとなった。DIDSはVDAC阻害作用以外も報告されているので、VDACに特異的なツールを用いて15d-PGJ2によるアポトーシスへの関与をさらに解析する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Votage-dependent anion channel (VDAC)はミトコンドリ外膜に局在し、アポトーシスにおいて重要な役割を果たしている。VDAC 阻害剤である4,4-diisothiocyanatostil-benedisulfonic acid (DIDS)にはアポトーシスに対し促進作用と保護作用が報告されており、論争の的となっている。本研究では、アポトーシス誘導剤として内因性のneurodegenerative mediatorとして報告され、VDACを標的としているシクロペンテノン型プロスタグランジン15-deoxy-△12,14-prostaglandin J2 (15d-PGJ2) に着目した。ラット大脳皮質神経細胞初代培養系において、15d-PGJ2によるアポトーシスに対し、DIDSが促進・保護のいずれの作用を示すのか検討した。DIDSは15d-PGJ2によるアポトーシスに対して促進作用を示すことが明らかとなり、15d-PGJ2によるアポトーシスがVDACを介している直接的証拠は得ることが出来なかった。興味深いことに、DIDSは単独ではアポトーシスを介さずに神経細胞死を誘導した。
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| Strategy for Future Research Activity |
我々はこれまでに15d-PGJ2膜標的タンパク質として神経特異的エノラーゼや１４－３－３アダプター蛋白質等を報告してきたので、下記の計画を通して15d-PGJ2膜標的タンパク質の関与する神経細胞死の解析を行う。
１）我々の知る限り、中枢神経系において７つの細胞死が報告されている。プログラム細胞死としてアポトーシス、ピロプトーシス、フェロプトーシス、オートファジー様細胞死とネクロプトーシス、事故的細胞死としてネクローシスとオンコーシスが知られている。抗NSE抗体による神経細胞死が新規細胞死か否かを調べるために、ATPの細胞内含量、ユビキチン-プロテアソーム系以外のタンパク質分解酵素（カルパイン・カテプシン等）、PI取り込み、クロマチン凝集、DNA断片化、形態変化等を指標に今後評価する予定である。
２）HSPA8は癌細胞表面に発現していることが知られている。我々は15d-PGJ2膜標的タンパク質の一つとしてHSPA8を既に報告している。脳卒中等で増加するHSPA8には神経細胞保護効果が知られているが、同様に増加する抗HSPA8抗体が神経細胞にどのような影響を与えうるのかは不明である。HSPA8が神経細胞の表面にも局在していることを見出しているので、15d-PGJ2によるアポトーシスが膜HSPA8を介しているのか否かを抗HSPA8抗体を用いて今後解析する。
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| Causes of Carryover |
当初，15d-PGJ2標的タンパク質として同定したNSE,PKM1, GAPDH, HSPA8, TCP-1α等の機能解析を行う予定であった。しかしながら、姉の突然死に伴い母親の介護を中心的に担う必要が生じたため、計画通りに実験を遂行できなかった。本年度は、主にVDACに集中して解析し、他の標的の解析が出来なかったため、未使用額が生じた。このため、次年度はVDAC以外の15d-PGJ2膜標的タンパク質についても機能解析を行い、また研究発表も行い、未使用額はその経費に充てることとしたい。
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