2017 Fiscal Year Research-status Report
Search for natural products which inhibit Entamoeba histolytica NAD kinase
| Project/Area Number |
17K08344
|
|---|
| Research Institution | Kitasato University |
|---|
Principal Investigator |
森 美穂子 北里大学, 感染制御科学府, 助教 (20425648)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | 赤痢アメーバ / NAD kinase / 微生物代謝産物 / 化合物ライブラリー |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
赤痢アメーバ原虫が大腸に寄生して起こる赤痢アメーバ症は、全世界に4,000万人以上の感染者が存在し、途上国では多数の死者が出ている深刻な感染症である。長年使用されている治療薬である抗菌・抗原虫薬のメトロニダゾールには耐性原虫の出現、催奇形性等の問題があるため、新たな赤痢アメーバ症治療薬の開発が求められている。即戦力となる治療薬シーズを見出すことを目的に、本研究では赤痢アメーバの生育に必須で、ヒトを含む他生物のものとは異なる性質を持つ酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドキナーゼ（NAD kinase）を標的に選び、阻害化合物の探索を行う。探索源には構造多様性に富む微生物代謝産物を用いて赤痢アメーバのNAD kinaseを選択的に阻害する天然化合物を見出す。
2017年度は共同研究先の東京大学野崎博士のグループと協力し、スクリーニング系の構築を開始した。大腸菌で発現させた赤痢アメーバのNAD kinaseを用いて酵素反応を行い、生成したNADPHを同じく大腸菌で発現させた赤痢アメーバのNADPH-dependent oxidoreductaseとINT（iodonitrotetrazolium chloride）を組み合わせたカップリングアッセイで検出する方法を96穴プレートに適用した。初めに酵素と基質の添加量、反応時間の最適化を行い、酵素反応によるNADPH生成が検出されることを確認した。次に、微生物培養液640サンプルを用いて実際にスクリーニングを行ってみたが、全体にINTが還元されて生成するホルマザン色素が沈殿しやすくなる傾向が見られた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
微生物培養液をアッセイ系に添加するとNADPH-dependent oxidoreductaseによる反応生成物であるINTホルマザン色素が沈殿しやすくなり、プレートリーダーによる吸光度測定がうまくいかない傾向が確認された。
現在用いている組換え酵素は、タンパク量あたりの活性が低く、アッセイに大量の酵素を必要とする。そのため、酵素の調製がアッセイ系の改良に間に合わず、進捗が遅れてしまった。
|
| Strategy for Future Research Activity |
(1) 組換え大腸菌による赤痢アメーバNAD kinase及びNADPH-dependent oxidoreductaseの生産性を向上させる。具体的には、共同研究先の野崎博士のグループと協力して、培養培地ならびに培養条件の検討を行う。
(2) 酵素活性測定にはINT試薬でなく可溶性ホルマザン色素であるWST-8を用いて検出を行う。他にも構造の異なる色素が市販されているため、本アッセイ系に適用可能な色素を検討する。
(3) 微生物培養液を含む条件下でアッセイが可能な系を確立して、スクリーニングを進める。過去にNAD kinaseを阻害する天然化合物の報告例がないため、構造既知の天然化合物で構成される北里天然化合物ライブラリー（約400化合物）を用いてスクリーニングを行った後、微生物培養液サンプルのスクリーニングへ移行する。
(4) 本アッセイ系で用いるNAD kinaseならびにNADPH-dependent oxidoreductaseを阻害する化合物を見出し、共同研究先の野崎博士のグループと協力して赤痢アメーバ型酵素に特異的であるかを調べる。
|
| Remarks |
日経産業新聞 2017年4月12日 12ページ「先端技術」内「赤痢アメーバに効く物質」
農芸化学会2017年度大会で発表した内容が記載。
|
-
-
[Journal Article] Characterization and validation of Entamoeba histolytica pantothenate kinase as a novel anti-amebic drug target.2018
Author(s)
Nurkanto, A.; Jeelani, G.; Yamamoto, T.; Suematsu, M.; Naito, Y.; Hishiki, T.; Mori, M.; Shiomi, K.; Hashimoto, T.; Nozaki, T.
-
Journal Title
International journal for parasitology. Drugs and drug resistance
Volume: 8
Pages: 125-136
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
-
[Journal Article] Biochemical studies of membrane bound Plasmodium falciparum mitochondrial L -malate:quinone oxidoreductase, a potential drug target2018
Author(s)
Hartuti, E. D.; Inaoka, D. K.; Komatsuya, K.; Miyazaki, Y.; Miller, R. J.; Wang, X.; Sadikin, M.; Prabandari, E. E.; Waluyo, D.; Kuroda, M.; Amalia, E.; Matsuo, Y.; Nugroho, N. B.; Saimoto, H.; Pramisandi, A.; Watanabe, Y.; Mori, M.; Shiomi, K.; Balogun, E. O.; Shiba, T.; Harada, S.; Nozaki, T.; Kita, K
-
Journal Title
Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics
Volume: 1859
Pages: 191～200
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
-
-
[Journal Article] 1-Methoxypyrrole-2-carboxamide - A new pyrrole compound isolated from Streptomyces griseocarneus SWW3682017
Author(s)
Wattanasuepsin, W.; Intra, B.; Panbangred, W.; Euanorasetr, J.; Watanabe, Y.; Fukasawa, W.; Mingma, R.; Mori, M.; Matsumoto, A.; Shiomi, K.
-
Journal Title
Journal of General and Applied Microbiology
Volume: 63
Pages: 207-211
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
-
