2017 Fiscal Year Research-status Report
AMPKを標的とした天然物由来難治がん治療薬シーズの探索とその併用効果
| Project/Area Number |
17K08346
|
|---|
| Research Institution | Tokyo University of Pharmacy and Life Science |
|---|
Principal Investigator |
三巻 祥浩 東京薬科大学, 薬学部, 教授 (90229790)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
横須賀 章人 東京薬科大学, 薬学部, 講師 (20318190)
松尾 侑希子 東京薬科大学, 薬学部, 助教 (70434016)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | 抗腫瘍活性 / AMPK活性化作用 / 天然物 / 構造決定 / メトホルミン / 併用効果 / Juniperus horizontalis / ジテルペン類 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
AMPK活性化作用の評価法の確立では、リン酸化AMPK定量ELISAキット（フナコシ社製）の条件検討を行った。しかしながら、陽性対象として用いたメトホルミンとコントロールの蛍光発光強度に有意差を示す条件が見出せず、現在も条件検討を行っている。
抗腫瘍活性成分の検索では、ヒノキ科Juniperus horizontalis地上部のメタノール抽出エキスについて、シリカゲルカラムクロマト、逆相シリカゲルカラムクロマト、分取TLC、HPLCなどの手法を用いて、3種のビフラボン類、18種のリグナン類、7種のジテルペン類、3種のセスキテルペン類を単離した。これらの構造を、2次元NMRを中心としたスペクトル解析やX線結晶解析により明らかにした。その結果、リグナン1種とアビエタン型ジテルペンの1種は新規化合物であった。また単離された化合物について、HL-60細胞、A549細胞、TIG-3細胞（正常細胞）に対する細胞毒性を評価した。リグナン類の多くはポドフィロトキシン類縁化合物であり、ポドフィロトキシンの基本骨格を維持しているものは強い腫瘍細胞毒性を示した。ポドフィロトキシン類の2つのベンゼン環を繋ぐ6員環部が開環すると、腫瘍細胞毒性はそのほとんどで減弱したが、比較的強い腫瘍細胞毒性を維持しているものもあった。ジテルペン類やセスキテルペン類の腫瘍細胞毒性はリグナン類に比べ弱かったが、一部に腫瘍選択性が顕著なものも見出された。
近年、ジテルペン類のAMPK活性化作用が報告されていることから、今回単離されたジテルペン類のAMPK活性化を介した抗腫瘍活性が期待される。今後は、AMPK活性化作用の評価法を確立し、生薬・薬用植物エキスのAMPK活性のスクリーニングおよびJ. horizontalisから単離された化合物のAMPK活性化作用と抗腫瘍活性の相関を検討する。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成29年度に計画した実験項目は、生薬・薬用植物エキスのAMPK活性化作用の評価、AMPK活性化物質の探索、構造決定、腫瘍細胞毒性とAMPK活性化作用の相関の評価であった。
AMPK活性化作用の評価法の確立では、リン酸化AMPK定量ELISAキット（フナコシ社製）の条件検討を行った。本キットを用いると96ウェルプレート上で細胞を培養し、その後連続的に細胞のリン酸化AMPKを直接定量できる。ポジティブコントロールとしてメトホルミンを用い、A549肺腺がん細胞およびHepG2肝がん細胞に対する細胞毒性の評価と、AMPK活性化作用の条件検討を行った。現在のところ、メトホルミンとコントロールの蛍光発光強度が有意差を示す条件が見出せていない。したがって、平成29年度に計画していたAMPK活性化物質の探索は、平成30年度に実施する。
AMPK活性化作用の評価法の条件検討と並行して、抗腫瘍活性天然物の探索・構造決定を実施した。近年、ジテルペン類のAMPK活性化作用が報告されていることから、ジテルペン類を含むことが期待されたヒノキ科Juniperus horizontalis地上部の詳細な成分研究を行った。その結果、2種の新規化合物を含む、3種のビフラボン類、18種のリグナン類、7種のジテルペン類、3種のセスキテルペン類を単離し、2次元NMRを中心としたスペクトル解析により、それらの化学構造を同定した。これらJ. horizontalisから単離された化合物について、HL-60細胞、A549細胞、TIG-3細胞（正常細胞）に対する毒性を評価した。その結果、研究実績の概要で記したような結果が得られた。
現時点でAMPK活性化作用の評価法の確立には至っていないが、J. horizontalisより31種の化合物を単離・同定し、それらの腫瘍細胞毒性のスクリーニングは完了している。
|
| Strategy for Future Research Activity |
平成29年度はヒノキ科Juniperus horizontalis地上部の詳細な成分研究を行い、単離された化合物の化学構造を明らかにし、併せて腫瘍細胞毒性を評価した。平成30年度は、次の3項目の研究を重点的に実施する。
1) 市販の測定キットを用いて、AMPK活性化作用の評価法を確立する。その後、J. horizontalisより単離されたビフラボン類、リグナン類、ジテルペン類、セスキテルペン類のAMPK活性化作用を評価し、腫瘍細胞毒性とAMPK活性化作用との関連を明らかにする。
2) 生薬・薬用植物エキスもしくは天然物由来物質のAMPK活性化作用を評価する。活性が認められたエキスについては、AMPK活性化作用を指標に各種クロマトグラフィーを駆使して活性成分の単離を行う。さらに、2次元NMRを中心としたスペクトル解析により、単離された化合物の化学構造の決定を行う。
3) メトホルミンの抗腫瘍活性は腫瘍細胞のAMPKの活性化を機序とすることが知られているが、メトホルミン自体の抗腫瘍活性はそれほど強いものではない。そこで、メトホルミンの抗腫瘍活性を増強させる天然物の探索を行う。併用効果が認められた場合は、天然物自身には抗腫瘍活性がないこと、AMPK活性化阻害剤を添加することで、作用機序がAMPKの活性化であることを確認する。上記のうち、平29年度に達成できなかった、市販のキットを用いたAMPK活性化作用の評価法の確立を最優先課題として実施する。
|
