2018 Fiscal Year Research-status Report
AMPKを標的とした天然物由来難治がん治療薬シーズの探索とその併用効果
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17K08346
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| Research Institution | Tokyo University of Pharmacy and Life Science |
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Principal Investigator |
三巻 祥浩 東京薬科大学, 薬学部, 教授 (90229790)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
横須賀 章人 東京薬科大学, 薬学部, 講師 (20318190)
松尾 侑希子 東京薬科大学, 薬学部, 助教 (70434016)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 細胞毒性 / 抗腫瘍活性 / AMPK活性化 / 天然物 / メトホルミン / 併用効果 / HepG2細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
AMPK活性化作用の評価法としては、昨年度と使用するキットを変更した。新たにCycLex AMPK Kinase Assay Kit（サイクレックス社製）の条件検討を行い、HepG2ヒト肝がん細胞を用いたELISA法によるAMPK活性化作用の評価法を確立した。
メトホルミンの細胞毒性は、腫瘍細胞のAMPKの活性化を機序とすることが知られているものの、メトホルミン単独ではそれほど強い細胞毒性は示さない。そこでメトホルミンの細胞毒性を増強させる生薬エキスの探索を行った。生薬エタノール抽出エキス40種について、HepG2細胞に対するメトホルミンとの併用効果をMTT法により評価した。その結果、生薬イレイセン（威霊仙）のエタノール抽出エキスが単独投与では毒性を示さない濃度で、メトホルミンの細胞毒性を増強させることを見出した。
続いてイレイセンの基原植物の一つである、キンポウゲ科Clematis mandshuricaの根および根茎（10 kg）を用いてメトホルミンの細胞毒性を増強させる成分の探索、ならびに単独でAMPK活性化を介して細胞毒性を示す成分の探索を開始した。現在、メタノール抽出エキスについて、各種クロマトグラフィーを用いて分離・精製を行い、活性成分の同定を試みているところである。
さらに、AMPK活性化を介した細胞毒性成分の探索として、ヒノキ科Juniperus horizontalis地上部より単離したジテルペン類について、HepG2細胞に対するAMPK活性化作用を検討した。しかし、これらジテルペン類は有意なAMPK活性化作用を示さなかった。近年、ジテルペン類のAMPK活性化作用が多く報告されているため、引き続きジテルペン類のAMPK活性化を介した細胞毒性の評価を行っていく予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成30年度に計画した実験項目は、1) AMPK活性化作用の評価法の確立、2) 生薬・薬用植物エキスもしくは天然物由来物質のAMPK活性化作用を介した細胞毒性の評価、3) メトホルミンの腫瘍細胞に対する細胞毒性を増強させる天然物の探索の3項目であった。
1) では、昨年度使用していたアッセイキットを変更して、新たにCycLex AMPK Kinase Assay Kit（サイクレックス社製）を使用し条件検討を行った。その結果、実験操作の工程数は増えたものの、陽性対照として用いたメトホルミンとコントロールの吸光度が有意差を示す条件を見出すことができた。
2) では、昨年度Juniperus horizontalis地上部より単離した化合物のうち、腫瘍細胞選択的に細胞毒性を示すジテルペン類のAMPK活性化作用を評価した。これらジテルペンで処理したHepG2細胞はAMPKを活性化する傾向があったものの、コントロールに対して有意な差を認めなかった。
3) では、生薬メタノール抽出エキス40種のスクリーニングを行った。メトホルミンと生薬エキスをHepG2細胞に同時投与し、細胞増殖率の変化をMTT法により評価した結果、メトホルミンの腫瘍細胞に対する細胞毒性を増強させる生薬としてイレイセン（威霊仙）を見出した。イレイセンには抗腫瘍活性、抗炎症活性が報告されており、含有成分としてアルカロイドやトリテルペン配糖体が知られている。現在はイレイセンに含まれる活性成分の探索を行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は、昨年度確立したAMPK活性化作用の評価法をもとに、研究をさらに発展させるため、以下の2項目を重点的に実施する。
1) メトホルミンの細胞毒性を増強させる天然物の探索を目的として、イレイセンの成分探索と単離された化合物の構造解析を行うとともに、メトホルミンの細胞毒性を増強させるか否かをMTT法で検討する。併用によりメトホルミンの細胞毒性が増強した場合、細胞死の様式がアポトーシス、ネクローシス、オートファジーのいずれであるかを、細胞染色による形態観察、カスパーゼ3などの酵素活性の測定、細胞周期解析、断片化DNAの観測、ウエスタンブロッティング法による関連タンパクの発現の観測などから評価する。さらにメトホルミンとイレイセンから単離された化合物を同時投与する直前に、AMPKの阻害剤であるドルソモルフィンを添加し、メトホルミンの細胞毒性を増強させる作用機序がAMPK活性化であるか否かを評価する。活性評価に用いる細胞はこれまでのHepG2細胞に加え、A549ヒト肺がん細胞、MIA Paca-2ヒト膵がん細胞なども検討することとする。また新たな生薬・植物エキスについて、メトホルミンの細胞毒性を増強させる効果のスクリーニングを継続して行う。
2) 生薬・薬用植物エキスもしくはAMPK活性化作用を介して細胞毒性を示す天然有機化合物の探索を目的として、イレイセンから単離した化合物、Juniperus horizontalis地上部より単離したすべてのジテルペン類、当該教室所有の天然物ライブラリーの活性を評価する。
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Research Products
(1 results)
