2017 Fiscal Year Research-status Report
エリスロポエチン遺伝子発現制御機構を利用した新規貧血改善薬の開発
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17K08361
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
平野 育生 東北大学, 医学系研究科, 助教 (00708117)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | Erythropoietin / ハイスループットスクリーニング / GATA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでに私は腎臓特異的なEpo遺伝子の転写調節に重要な領域を同定し、同領域を介した転写制御機構を障害することで、腎臓以外の組織からのEPO産生をGFP蛍光でモニター可能なマウス（δCURE-GFP）や腎臓EPO産生欠如による慢性貧血を示すマウスを報告した。またEpo遺伝子を負に制御していることが知られているGATA転写因子に注目し、ヒト慢性骨髄性白血病細胞株であるK562を利用したハイスループットスクリーニング（HTS）系を樹立し、HTSにより上皮系細胞において異所性にEpo遺伝子の転写を誘導可能な薬剤としてMitoxantroneを同定し報告した。
本研究では、上皮系細胞からのEPO誘導能を持った化合物のさらなる探索を行うためδCURE-GFPの上皮系細胞を用いたHTS系の樹立を想定していたが、初代培養細胞からのHTS系の樹立は困難を極めることから、マウス腎集合管上皮細胞由来細胞株mIMCDおよびヒト肺胞基底上皮腺癌由来細胞株A549を用い、Epo遺伝子領域へNluc遺伝子を挿入することでHTS系を樹立した。
当該年度ではmIMCD細胞株を用いたスクリーニング系を用い、東北大学薬学部化合物ライブラリー内の6080個の化合物を対象にHTSを実施し、その結果、新たに化合物Aを新規EPO産生誘導能のある化合物候補として同定した。化合物Aによる上皮系細胞からのEpo遺伝子発現誘導能を検証するため、A549細胞株やヒト総胆管癌由来細胞株TFK-1などの細胞へ化合物Aを添加した結果、EPO遺伝子の発現が有意に増加した。さらに、マウス個体への化合物A投与実験においても、対照群と比較し有意なEpo遺伝子の発現誘導が肺において確認された。この結果は、実際に化合物Aが異所性のEPO誘導剤としても利用可能である可能性を示している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本研究はハイスループットな化合物スクリーニングによるEPO誘導能のある化合物の選定が主な目的の一つとなっている。ハイスループットスクリーニング（HTS）系の樹立に際し、当初はdCURE-GFPマウス肝実質細胞やアストロサイトを用いたスクリーニング系の樹立を想定していたが、事前の条件検討の結果、初代培養からの不死化やHTSとして使用可能な細胞株の樹立はかなりの労力と時間が必要となることが予想された。一方で同時に進行させていた、ヒト慢性骨髄性白血病細胞株K562のEPO遺伝子領域にレポーター遺伝子を導入した細胞株を用いたHTS系は期待通りの良い結果を示した。そこで、研究手法をマウス腎集合管上皮細胞由来細胞株mIMCDおよびヒト肺胞基底上皮腺癌由来細胞株A549を用いた方法に方向転換した。その結果、期待通りmIMCDを用いた有効なスクリーニング系が比較的短時間で樹立され、HTSの実施の結果新たな候補化合物も得られた。当初の全研究過程では平成30年度にHTSを実施する予定であったことを考えると、現状は当初の予定以上に進展していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は得られている化合物の有効性を個体レベルで詳しく解析し、実際に薬剤として開発が期待される化合物を選定していく必要があるが、現状ではEPO誘導能が期待される化合物が２つしか同定されておらず、より多くの候補化合物が必要であると考えている。また、最終的にヒトに有効な薬剤を同定したいと考えているため、ヒト肺胞基底上皮腺癌由来細胞株A549を用いたスクリーニング系の樹立とHTSの実施を行いたいと考えている。これまでに同定された候補化合物、今後同定される化合物はそれぞれ野生型マウスへの投与実験により個体レベルでの作用の確認と作用機序を明らかとする予定である。また、腎性貧血モデルとして利用可能なAnREDマウスへの投与実験により、その治療効果を検証したいと考えている
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| Causes of Carryover |
当初の研究計画ではdCURE-GFPマウスからの肝実質細胞やアストロサイトの初代培養および株化が予定されていたが、既存の細胞株を利用したレポーター細胞株の樹立に方法を切り替えたため、その分の金額が次年度使用額として計上されている。
次年度はA549を用いた新たなレポーター細胞株の樹立とハイスループットスクリーニングの実施を予定しており、計上した次年度使用額は新たに追加したこれらの解析に用いる予定である。
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