2017 Fiscal Year Research-status Report
核内受容体PXRによる肝細胞増殖制御：機序及びヒト影響の解明
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17K08418
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| Research Institution | University of Shizuoka |
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Principal Investigator |
吉成 浩一 静岡県立大学, 薬学部, 教授 (60343399)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐々木 崇光 静岡県立大学, 薬学部, 講師 (20382674)
保坂 卓臣 静岡県立大学, 薬学部, 助教 (30611579)
志津 怜太 静岡県立大学, 薬学部, 助教 (50803912)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 肝毒性 / 細胞増殖 / 核内受容体 / 化学物質 / 肝 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は異物応答性のPXRが肝細胞増殖調節作用を有することを見出した。本研究では、肝細胞増殖シグナル調節因子であるYAPとPXRの相互作用ならびに肝発がんへのPXRの寄与を明らかにすることを目的とした。
マウス及びヒトのYAPとPXRの分子間相互作用を、哺乳細胞ツーハイブリッドシステムにより解析した。その結果、マウス及びヒトのいずれにおいてもYAPとPXRは相互作用しないことを示唆する結果が得られた。
PXRの肝細胞増殖増強作用に対するYAPの寄与を明らかにするために、不死化マウス肝細胞のAML12細胞にEGFを処置して細胞増殖を誘発し、さらにマウスPXR（mPXR）をアデノウイルスを用いて発現させて細胞増殖を増強した。この時、YAP阻害薬verteporfinの共処置又はsiRNAによるYAPのノックダウンを行ったところ、YAPの機能阻害はEGF依存的な増殖を抑制したが、PXRの細胞増殖増強作用には影響を与えなかった。
インビボでのYAPとPXRの相互作用並びにPXRの肝発がんへの関与を解析する予備検討として、mPXRリガンドPCNを雄性C3Hマウスに1週間混餌（100、200、500、1000 ppm）投与したところ、200 ppmで肝重量が明確に増加し、PXR標的遺伝子のCyp3a11のmRNAレベルは100 ppmで約９倍、500及び1000 ppmでは約16倍に増加した。しかし、細胞増殖の指標であるMcm2のmRNAレベルは変化しなかった。次いで、雄性C3HマウスにマウスCAR活性薬で肝発がんプロモーターのフェノバルビタール（PB；100、500 ppm；給水投与）とPCN（100 ppm；混餌投与）を1週間併用投与したところ、PBによるMcm２ mRNAレベルの増加はPCNの併用により増強された。以上の実験により、肝がんプロモーターとの長期曝露条件を決定できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
インビボ実験を行うにあたり、マウスPXRリガンドであるPCNが大量と必要となる。市販品の規格サイズは小さく、大量購入すると膨大な金額となるため、PCNの化学合成を受託することとした。その結果、国外での合成となったため、出荷までの事務手続きにかなりの時間を要し、大規模のインビボ実験の開始時期が遅れた。
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| Strategy for Future Research Activity |
哺乳細胞ツーハイブリッドアッセイにより、マウス及びヒトのいずれにおいてもPXRとYAPは相互作用しないことが示唆された。そこで、培養細胞やマウス肝を試料として共免疫沈降を行い、分子間相互作用を確認する。
さらにマウスPXRとヒトPXRの機能的な種差を明らかにするために、ヒト肝癌由来HepG2細胞や初代培養ヒト肝細胞を利用してヒトPXRがこれら肝細胞の増殖に及ぼす影響を、細胞生物学手法等を利用して解析する。
PXRの肝発がんへの関与を明らかにするために、雄性C3Hマウスに肝がんイニシエーターであるジエチルニトロソアミンを投与し、その２週間後から29年度に決定した用量のPCN及びフェノバルビタールをマウスに数十週間共処置し、肝の発がん前駆マーカーの変動等を解析する。
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| Causes of Carryover |
インビボ実験の開始時期が遅れ、平成29年度に実施予定であった実験が、平成30年度５月までかかってしまったため、平成30年度に一部予算を使用した。
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