2018 Fiscal Year Research-status Report
頭蓋底正中部骨格原基の初期形成の場として，口窩天井部に注目した解析
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17K08498
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| Research Institution | Tokyo University of Science |
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Principal Investigator |
和田 直之 東京理科大学, 理工学部応用生物科学科, 教授 (50267449)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 口窩 / 頭蓋底軟骨 / Foxf1 / ニワトリ / マウス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
頭蓋底骨格の正中部分は軟骨性骨格として，頭部発生の比較的初期から形成される。本研究課題では，口窩天井部での軟骨原基形成の詳細や構成する細胞の発生系譜，制御する分子群の解明を目指している。本年度は以下の実験を行った。
１．ニワトリ胚口窩天井で発現する分子と頭蓋底軟骨原基形成：口窩天井で発現する分子のうち，Bmp3bについて解析するため，これを安定して発現する細胞株を確立した。効果を確認するために肢芽や顔面隆起に移植を行なったが，微小な変化にとどまっている。一方，口窩天井部で軟骨形成に先行して発現する転写因子としてFoxf1に注目し，ニワトリレトロウィルスRCASを用いたin vivo解析を試みたが，発現させた個体が骨格形成以前に致死となり，解析ができていない。ゼブラフィッシュ受精卵にmRNAを導入して過剰発現の効果を検討した結果，篩骨板の融合不全などが観察された。
2. ニワトリ全胚培養系の確立：2.5-3.0日胚の口窩天井領域の発生運命地図の作成のために，全胚培養系の確立を試みた。いくつか条件を検討した結果，より初期胚の全胚培養法であるNew culture法を改変して，最終的に2.5日胚を4.5日胚程度になるまで発生・維持することが可能となり，この系を使って口窩天井部の標識と以降の追跡が可能であることも確認できた。
3. マウス胚での口窩天井の形態変化：E10.5～E12.5胚での口窩天井部の形態変化を調べた。E10.5では口窩天井部と脳胞底部の間は1-2層の間葉細胞が分布するだけだったが，E11.5胚では口窩天井前部では背腹方向に厚みを増し，鼻中隔となる膨らみとなった。後部では厚くはならず，増殖の不均一性が示唆された。ニワトリ胚で発現していたFoxf1は，軟骨形成部位の一部でしか重複せず，軟骨原基の不均一性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
実験自体は概ね順調で，実験に応じた実験結果も出ているが，一方で遺伝子発現操作胚の生存率が非常に低く解析が難しい場合があったこと，また実験結果によってはそれ以降に予定していた実験を見直す必要が生じるなど，全体に時間がかかる問題があり，全体としてはやや遅れ気味ではある。
1. 口窩天井で発現する分子と頭蓋底軟骨原基形成については，Bmp3bの機能解析ができていない。発現細胞移植部位の検討などを行なっており，期間内には機能について何らかの情報が得られるものと考えている。口窩天井部で梁軟骨に先行して発現するFoxf1については，ニワトリ胚での過剰発現系では，発現させた個体が骨格形成以前に致死となり，解析が遅れている。ゼブラフィッシュ胚ではfoxf1 mRNA導入により頭蓋底軟骨形成への影響を確認できており，Foxf1は軟骨形成に対して機能を持っていることは強く推察されるが，その検証には従来とは別のアプローチが必要と考えられる。
2. 前年度，確立できなかった全胚培養系については，今年度は目的とする2.5日胚の培養系がおおむね確立できた。次に解決する問題点として，4.5日胚までしか培養ができないこと，培養した頭顔面形態にやや歪みが観察されることなどが明らかになった。今後，軟骨形成が明瞭になる発生段階まで進行させるため，従来法に付加する形で新しい視点での培養条件の検討が必要となる
3. マウス胚での口窩天井の形態変化：この課題については，正中部の形態変化が起こる時期とその形状についての知見が得られたので，おおむね予定通りである。残りの期間で，E10.5～E11.5の詳細な形態変化を調べるために，全胚培養系を用いた解析が必要と考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. 口窩天井で発現する分子と頭蓋底軟骨原基形成：Bmp3bとFoxf1の機能解析を進める。Bmp3bについては，発現細胞を口窩天井に移植した時の頭蓋底軟骨形態の変化を調べる。一方，口窩天井部で発現するFoxf1については，従来通りのin vivoでの解析は行うが，並行して培養系を用いて発現細胞の形状や軟骨分化への影響を調べ，Foxf1が軟骨形成やその領域特異性形成に置ける役割について，情報を得たい。併せて，口窩天井部では他のFox遺伝子も発現することが報告されているので，頭蓋底軟骨形成とFox遺伝子群の発現部位との関連を調べる。
2. ニワトリ胚の全胚培養系を用いた系譜解析：18年度に確立できた2.5日胚の培養系を用いて，口窩天井部の系譜解析を進める。現段階では，4.5日胚までしか培養ができないが，初期に形成される軟骨については発生系譜・発生起源を知ることができると考えている。一方，軟骨形成が明瞭になる発生段階まで進行させるため，培養時に胚を載せる寒天床の形状や，培地の条件について従来法に付加する形で検討する。これについては，過去に同様の視点で行われた実験があるので，これを参考に改良を進める。
3. マウス胚での口窩天井の形態変化：これまでの解析で，E10.5～E11.5の間に顔面の大きな変化があることがわかった。この期間に起こる形態変化の詳細を調べるために，全胚培養系を用いた解析が必要なので，第一に全胚培養系を確立させる。この後，E10.5から11.5の間の様々な段階で胚を固定して，鼻中隔形成過程をおった組織切片や遺伝子発現のデータを得る。また可能であれば細胞増殖や細胞移動，極性についても調べたい。
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| Causes of Carryover |
H30年度の執行額は約87万円であり，本研究課題の開始時に配分された２年次の配分額（90万円）とほぼ同額である。今年度の繰り越し額は前年度に繰り越された額とほぼ同じであることから，次年度への繰り越しが生じた理由としては，H30年度の実験を当初に配分された２年次の枠内で執行したためと考えている。2019年度（H31年度）は，マウス全胚培養系の確立のため，マウス購入の頻度が増え，また培地としての血清購入など消耗品類の支出が増えることが確実なこと，研究成果発表（学会参加，論文公表）などでも支出が増えることから，繰り越した額は問題なく使用できるものと考えている。
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