2017 Fiscal Year Research-status Report
皮膚感覚装置におけるニューロン－グリア相互作用の細胞内Na+濃度画像解析
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17K08504
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
岩永 ひろみ 北海道大学, 医学研究院, 准教授 (30193759)
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2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 細胞組織化学 / カルシウム画像 / 槍型感覚終末 / Naイオン感受性蛍光プローブ / グルタミン酸 / ラット |
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| Outline of Annual Research Achievements |
グリア細胞はNa+共輸送体を介して神経伝達物質を回収し，正常なニューロン活動を助ける。ラット頬ひげの動き受容器 槍型感覚終末とその周辺には，槍型軸索終末を被うグリア薄板をつくる終末シュワン細胞，槍型終末に入る有髄線維に随伴する髄鞘形成シュワン細胞，ニューロン軸索に接触しない星形シュワン様細胞，の三種のグリア細胞がみられる。これらが槍型軸索終末から自己分泌的に放出されるといわれる伝達物質グルタミン酸を取り込んだときの細胞内Na+濃度変動をとらえることを目的とし，以下の実験１，２を行った。
実験１．頬ひげ毛包から分離した槍型終末標本にCa2+感受性プローブFura-2のAM体を負荷して倒立式蛍光顕微鏡のステージに載せ、細胞外からグルタミン酸等を与えたときの細胞内Ca2+濃度変動を蛍光比画像（励起光波長340 nm/380 nm）として記録・解析した。
実験２．実験1と同じ光学系を用い，Na+感受性蛍光プローブ SBFIのAM体を負荷した槍型終末分離標本にグルタミン酸刺激をあたえたときの細胞内Na+濃度変動を蛍光比画像で記録・解析した。なお，観察目的細胞同定のため，分離標本はすべて実験後ホルマリン固定し，グリア・マーカーS100蛋白の免疫染色を行った。
実験１では，髄鞘形成シュワン細胞がグルタミン酸1 mMの刺激に対し，一過性細胞内Ca2+濃度上昇をもって応答するのが観察された。これに対し，終末シュワン細胞と星形シュワン様細胞は同刺激に不応だった。
実験２では，分離標本をグルタミン酸1 mMで刺激したとき，髄鞘形成シュワン細胞の核周辺細胞質に一致する画像記録領域に緩やかなSBFI蛍光比上昇が検出された。この変化がグルタミン酸輸送体の活性化に基づくかどうかを検証するため，さらに，蛍光検出感度の高い光学系を用いた画像解析を行う必要がある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成29年度は，(1) SBFI蛍光比を指標とした細胞内Na+濃度変動画像化法をラット頬ひげ槍型感覚終末の分離標本に応用し，これを用いて，(2)槍型終末にまつわる3種のグリア細胞（髄鞘形成シュワン細胞，終末シュワン細胞，星形シュワン様細胞）に様々な刺激を与えたときの応答をとらえ，(3)その細胞応答に関わる膜受容体・輸送体等の生理薬理学的性質を明らかにすることを計画していた。上記(1)(2)に関しては，ノイズのため観察目的細胞を区別するのに十分な画像解像度を得るのが困難であったが，髄鞘形成シュワン細胞でグルタミン酸刺激に対する応答と思われるSBFI蛍光比上昇を2例記録することができた。しかし，再現実験が難しく，刺激と遮断剤をさまざまな組み合わせで行う上記(3)に進むことはできなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
観察目的細胞のNa+濃度画像記録頻度向上と画像の信号/ノイズ比改善が本研究の推進に必須である。その対策として，グリア細胞が蛍光を発するS100β-EGFPトランスジェニックラットの分離槍型終末標本に前年度行った画像化法を応用し，あらかじめGFP蛍光観察（励起光480 nm）で目的細胞の焦点合わせを正確に行った後，同一視野でSBFI蛍光比画像記録（励起光波長340 nm/380 nm）を行うことを計画している。その予備実験として，上記トランスジェニックラットから得た分離標本に，SBFIと同様の励起・蛍光波長特性を示すCa2+感受性試薬Fura-2をプローブとしたカルシウム画像化法を応用し，同一標本上でのGFP蛍光とFura-2蛍光比観察が有効であることを確認した。また，空間・時間分解能のさらなる向上をめざし，二光子励起顕微鏡でのSBFI蛍光像（励起光380 nm相当）の観察を試みる予定である。
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| Causes of Carryover |
トランスジェニックラットの分離槍型終末標本でNa+画像解析を行う予定だったが，ラットの繁殖が計画通り進まなかったため多くの実験を行うことができず，実験のための高価な試薬（遮断剤等，使用期限は納品後1か月以内，価格は実験1回分平均2万円）の購入を控えなければならなかった。その後，繁殖が順調に進むようになり実験の準備が整ったので，未使用額はそれらの試薬購入にあてる予定である。
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