2018 Fiscal Year Research-status Report

余剰分泌顆粒のゆくえ：GnRH誘導体を活用した新規クリノファジー解析実験系の構築

Research Project

Project/Area Number	17K08505
Research Institution	Asahikawa Medical College
Principal Investigator	渡部剛旭川医科大学, 医学部, 教授 (80220903)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	GnRH誘導体 / 分泌顆粒形成 / 下垂体前葉 / 性腺刺激ホルモン産生細胞 / クリノファジー / 電子顕微鏡観察 / 曲精細管上皮 / 精子形成
Outline of Annual Research Achievements	陳旧化した内分泌細胞の分泌顆粒は細胞内でクリノファジーという過程により分解処理されると考えられているが、これまで適切な解析実験系がなく詳細については不明の点が多い。そこで本研究では、下垂体前葉の性腺刺激ホルモン（LH/FSH）産生細胞に対するGnRHアゴニストとアンタゴニストの作用の差に着目して、細胞内で陳旧化した余剰の分泌顆粒の特徴や運命を明らかにしようとしている。 2017年度までに、GnRHアゴニストあるいはアンタゴニストの徐放性製剤を投与した雄ラットから生化学的解析と形態学的解析のための下垂体組織標本を様々な時間経過で系統的に作成した。また、LHとFSHの標的臓器である精巣組織の変化を形態学的に解析することで、この実験系の妥当性を評価した。その結果、血漿LH濃度については、GnRHアゴニスト投与群とアンタゴニスト投与群の両者とも予測どおりの経時的推移を示し、動物実験モデルの妥当性が実証された。一方、精巣重量はLH濃度の推移と呼応して減少するものの、曲精細管上皮の組織像はGnRHアゴニスト投与群とアンタゴニスト投与群で大きく異なる変化を示した。そこで2018年度には、KOH消化で膠原線維を除去した精巣標本を走査型電子顕微鏡で観察し、GnRH誘導体持続投与時の曲精細管上皮の立体微細構造の経時的変化を解析した。その結果、GnRHアゴニスト投与群では、投与開始直後にセルトリ細胞間の接着が緩み未熟精子細胞が曲精細管上皮から大量に剥落することを見出した。一方、GnRHアンタゴニスト投与群では時間経過とともにセルトリ細胞の丈が低くなり、徐々に精子細胞が上皮から脱落することを明らかにした。以上の曲精細管上皮に対するGnRH誘導体持続投与の影響の差異に関しては、各実験群の血漿LH濃度の経時的変化のデータと併せて、研究成果欄に記載した原著論文（2）として発表・報告した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 当初の研究計画で2018年度までに予定していたGnRH誘導体を持続投与した雄ラットからの形態学的解析および生化学的解析用の標本（下垂体及び精巣）の作製・採取は完了した。また、この実験モデルの妥当性の検証を目的として行った血漿LH濃度の測定と精巣組織の解析についても完了した。一方、本研究の当初の目標である下垂体性腺刺激ホルモン産生細胞における余剰分泌顆粒の処理過程の解明については、現在、性腺刺激ホルモン（LH、FSH）や分泌顆粒基質蛋白（クロモグラニンA、セクレトグラニンII）に対する特異抗体を用いて、免疫組織化学染色でその経時的変化の検討を進めているところである。精巣に対するGnRH誘導体持続投与の影響に関する解析で予期せぬ興味深い所見を得たため、本来予定していた下垂体前葉性腺刺激ホルモン産生細胞の解析は若干遅れているが、精巣の所見については平成30年度に成果を原著論文としてまとめることができた。このような状況を踏まえて、本研究は全体としてはおおむね順調に進展していると判断した。
Strategy for Future Research Activity	当初の研究計画で予定していた、下垂体前葉の性腺刺激ホルモン産生細胞の分泌顆粒形成に対するGnRHアゴニストとアンタゴニストの影響の差異については、計画通り2019年度に免疫組織化学法と電子顕微鏡観察を組み合わせた相関顕微観察法で解析を進めていく予定である。またこのような観察で得られた所見を補強するために、適宜、形態計測法による定量的な形態解析、および下垂体組織抽出液のイムノブロット解析や定量的PCR法などの生化学的解析法を加味していく計画である。
Causes of Carryover	2018年度に予定していた系統的な下垂体組織標本の作成と準備的な検討が予想以上に順調に実施できたため、幸いなことに当初懸念していた至適条件を決定するための試行錯誤が不要になり、支出額が予算計上額よりやや少なくて済んだ。この結果、次年度以降に繰り越すことができた助成金は、2019年度に本格的に進める下垂体組織標本の形態学的解析及び生化学的解析の充実に充てる予定である。