2019 Fiscal Year Research-status Report
Study of cell lineage in the differentiation of mouse submandibular gland
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17K08510
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
井関 尚一 金沢大学, 医学系, 協力研究員 (50167251)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
仲田 浩規 金沢大学, 医学系, 講師 (80638304)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 顎下腺 / 導管系 / 細胞分化 / 性差 / アンドロゲン / マウス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マウス顎下腺の導管末端には出生時にまだ腺房がなく、暗い顆粒をもつ末端導管（TT）細胞と、明るい顆粒をもつ前腺房細胞がある。TT細胞は生後３週以降に次第に数が減少し、雄では生後５週以降は消失するが、雌では成獣に至るまで少数が介在部導管遠位端に残存する。TT細胞の生理的役割は不明であるが、特異的マーカーとして顎下腺C蛋白質（SMGC）が分泌顆粒中に存在する。本研究ではC57BL6系マウスでCRISPR-Cas9ゲノム編集を行い、SMGC遺伝子のエクソン３の一部に欠損を生じさせ、翻訳のフレームシフトによりSMGCの大部分が欠如するノックアウト（KO）マウスを作成した。KOマウスは特に異常なく生育し、成獣の顎下腺の形態は腺房および導管系とも正常であった。しかし出生から生後初期において、TT細胞のマーカーであるSMGCが欠如するのみならず、特徴的な顆粒をもつTT細胞そのものが存在しなかった。出生時の顎下腺の電顕観察では、TT細胞が欠如して未分化な導管細胞に置き換わっていた。一方、前腺房細胞は存在し、そこから正常な腺房が分化することが示唆された。すなわち、マウス顎下腺において、SMGCという分泌蛋白質の欠如によりTT細胞の分化そのものが起こらないこと、またSMGCおよびTT細胞の欠如は腺房および導管系の生後発達に影響しないことがわかった。KOマウスの顎下腺におけるSMGCのmRNA発現をin situ ハイブリダイゼーションで調べたところ、出生直後には末端導管に弱いながらもSMGCのmRNAが陽性の細胞が存在するが、生後発達の間に徐々にその数と発現強度が減少することがわかった。またSMGC以外のTT細胞特異的な遺伝子産物を探索したところ、生後４週の顎下腺RNAのマイクロアレイ解析において野生型マウスでKOマウスの２倍以上の発現を示す遺伝子が複数見出された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初計画では、マウスの誕生時に見られる２種類の導管系前駆細胞、すなわちSMGCで標識される細胞とK5で標識される細胞について遺伝子改変動物を作成し、生後発達における分化の道筋すなわち細胞系譜を調べることになっていた。しかし予算、設備、時間及び人員の制約から、SMGC標識前駆細胞の研究に対象を絞ることにした。当初計画ではSMGCのプロモータの下流に蛍光標識遺伝子および条件的致死遺伝子を導入したノックインマウスを作成することとしていたが、まず技術的により容易なSMGCノックアウト（KO）マウスを作成することにし、金沢大学の遺伝子改変動物分野との共同研究で進めてきた。KOマウスの作成とその表現型質の解析に時間がかかり、2017年度～2019年度までの３年間を費やして上記の結果を得たが、さらに研究を続けるために研究期間を2020年度まで延長した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今回作成したSMGCノックアウトマウスの系統を維持しつつ、以下のような研究を行う。
1) KOマウス顎下腺の末端導管にある細胞はSMGC蛋白質をつくらず、形態的にもTT細胞の表現型は示さないが、TT細胞に見られるSMGCのmRNA発現や生後のアポトーシスなどがあるのか、他の導管細胞に見られるマーカーの発現があるのか、などを調べる。
2) KOマウスの顎下腺の生理学的性質を調べる。野生型と比較して唾液の成分、顆粒性導管部分の発達と機能、顎下腺の再生実験における腺房の再生能などが異なるかなど。
3) KOマウス顎下腺とWTマウスの顎下腺RNAをマイクロアレイ法で比較して得られた、前者で少なく発現するいくつかの遺伝子産物について、それらがTT細胞の特異産物である可能性を組織化学により検証し、生後発達におけるそれらの発現と局在を見る。
4) 顎下腺におけるSMGCの機能を探究するため、顎下腺の総蛋白質を抗SMGC抗体で沈降して得られた産物に質量分析を行い、SMGCと結合している蛋白質を同定する。
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| Causes of Carryover |
遺伝子改変動物の作成をSMGCノックアウトマウスに絞ったこと、KOマウスの作成とその基本的な表現形質の解析に時間がかかったこと、さらに研究代表者が平成30年度に就職した新設大学でまだ研究体制が整っていないことなどもあり、研究計画の進行がやや遅れるとともに予算使用に余裕が生まれた。研究期間を延長した次年度は、作成したKOマウスを系統維持しつつさらに表現形質を解析するため、繰り越した経費を動物飼育費、抗体など形態学的研究に関連した製品の購入、及び遺伝子解析試薬など分子生物学的研究に関連した製品の購入に使用する。
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