2017 Fiscal Year Research-status Report
新規ガイダンス因子による神経新生と血管新生を組み合わせた脳梗塞再生法の開発
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17K08512
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| Research Institution | Hamamatsu University School of Medicine |
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Principal Investigator |
山岸 覚 浜松医科大学, 医学部, 准教授 (40372362)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | Netrin-5 / 軸索ガイダンス因子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
脳虚血後数日間の亜急性期には神経新生が盛んに行われ、神経機能の再生が試みられている。しかしながら新生神経細胞はやがて死滅してしまう。したがって、新生神経細胞を長期に渡り生存し、大脳皮質で神経細胞へと分化させることができれば、神経機能亢進につながると考えられる。我々は最近、神経新生領域で発現する新規神経軸索ガイダンス分子、Netrin-5を見出した(Yamagishi et al., Front Cell Neurosci, 2015)。Netrin-5は論文報告がほとんどなく機能未知だが、申請者は梗塞層新生血管、梗塞周囲層ミクログリア、側脳室→梗塞層へ移動中の新生神経細胞で強く発現上昇していることを見出した。したがって、①Netrin-5投与もしくは過剰発現による脳虚血時における再生治療の開発を試み、②Netrin-5ノックアウトマウスの梗塞モデルを作製し、分子機能・病態発症メカニズムの解明を試みた。
①Netrin-5脳室投与の為のリコンビナント精製について
HEK293細胞を用いてリコンビナントの精製を試みたが、残念ながら極僅かしかリコンビナントを得る事ができなかった。そこで、収量改善のため、プラスミドの改変を行った。・FLAGやMyc、His等小さなタグへの変更・pIgplusからpcDNA3やpcDNA4、pINFUSE等バックボーンの変更。しかしながら、どの条件においても放出されるNetrin-5は非常に僅かであり、十分量を得る事に成功していない。
②Netrin-5 ノックアウトマウスの解析
Netrin-5のノックアウトマウスは新潟大学脳研究所との共同研究で作成された。ノックアウトマウスの中大脳動脈を結紮し、脳梗塞モデルを作成したが、ノックアウトマウスはC57BL/6バックグラウンドであるため、個体によってバラツキが見られ、定量的な解析が現段階では非常に困難である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
①Netrin-5脳室投与の為のリコンビナントについて
Netrin-5 cDNA（マウス）をCMVプロモーター下で発現するpIgplusベクターへとクローニングした。当該ベクターはFcタグが付加されるため、抗Fc抗体により可視化でき受容体との結合アッセイが容易となる。HEK293細胞を用いてトランスフェクションし、培地から精製を試みたが、残念ながら極僅かしかリコンビナントを得る事ができなかった。そこで、多量のリコンビナントを得るため、プラスミドの改変を試みた。FLAGやMyc・His等小さなタグへの変更、pIgplusからpcDNA3やpcDNA4、pINFUSE等バックボーンの変更。しかしながら、どの条件においても、放出されるNetrin-5は非常に僅かであり、in vivoでの実験どころか、in vitroの実験を行うにも十分量を得る事ができなかった。
②Netrin-5 ノックアウトマウスの解析
Netrin-5のノックアウトマウスは新潟大学脳研究所との共同研究で作成された。loxPで挟まれている為、PGK-Creで全身性の、Nestin-Creで神経系の細胞でノックアウトを行った。Netrin-5ノックアウトマウスは全身性ノックアウトマウスでもメンデルの法則に従って生まれてくる為、発生上フェノタイプは特にないと思われる。また、日常的な観察でも、行動異常は見られなかった。中大脳動脈を結紮し、脳梗塞モデルを作成したが、ノックアウトマウスはC57BL/6バックグラウンドであるため、個体によってバラツキが見られ、定量的な解析が現段階では非常に困難であった。
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| Strategy for Future Research Activity |
①Netrin-5脳室投与の為のリコンビナントについて
上述の通り、リコンビナントが十分量得られていないため、その収量を上げるため、以下のことを試みる。N末シグナルペプチドの変更(実績のあるFLRT2、Netrin-1)、コザック配列の変更、カイコでの作成。リコンビナントが得られ次第、中大脳動脈結紮モデルを作成し、脳室内投与を試みる。そして、脳を固定し切片を作成して神経再生における機能を検討する。
②Netrin-5 ノックアウトマウスの解析
上述した通り、現段階における問題点として、C57BL/6バックグラウンドによるバラツキが挙げられる。安定した脳虚血モデルとして実績のあるCB-17系統にバッククロスを行い、中大脳動脈結紮モデルを作成する（Kasahara et al., Neurosci Res, 2013）。このバッククロスには時間が掛かる為、その間にノックアウトマウスにおける脳構造や神経新生異常が見られないかを検討する。
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| Causes of Carryover |
Netrin-5リコンビナントの精製の収量が少なく、in vivoでのインジェクションが出来ていない。したがって、インジェクションを伴う実験に掛かる費用については次年度へと繰り越すこととした。
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