マウス個体発生におけるPtch１とXIAPによる細胞死抑制メカニズムの解明

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K08513
• Research Institution: Hamamatsu University School of Medicine
• Principal Investigator: 青戸 一司 浜松医科大学, 医学部, 助教 (60360476)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: Ptch1 / XIAP / 細胞死抑制機構 / 繊毛 / HA tag ノックインマウス / GONAD法 / CRISPR-Cas9 / プロテオーム解析

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、マウス個体発生におけるPatched1(Ptch1)のC末端と、結合タンパク質X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP)などによる細胞死抑制機構の生理的役割の解明を目的とする。具体的には、１）CRISPR-Cas9法によってPtch1-CのXIAP結合部位の変異マウスを作製し、個体発生におけるPtch1-XIAPによる細胞死抑制の生理的役割とその分子メカニズムを解明する、２）Ptch1とXIAPへのタグノックインマウスを作製し、Ptch1とXIAPの線毛での局在変化を明らかにすることを目的としている。
平成３０年度は、迅速に変異マウスを作製する法として、妊娠が確定した雌マウスの卵管膨大部にCRISPR-Cas9の溶液を注入し、エレクトロポレーションによって受精卵のゲノムに変異を与える方法（GONAD法）により作製したPtch1のC末端のXIAPの結合部位欠損マウス（Ptch1-dIBS）、Ptch1のC末端への2xHAタグ挿入マウス（Ptch1-2xHA）の交配による個体数の増加と、ホモ変異体の経過観察を行った。しかしながら、Ptch1-dIBSのホモ変異体マウスでは月齢が半年以上経過しても、Ptch1のヘテロノックアウトマウスの30%に見られる皮膚、脳グリア、筋肉などにみられる癌化は観察されなかった。
一方で、Ptch1-2xHAホモ変異体では出生後に致死になる仔マウスが観察されたので、今後詳細に解析を行う予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

変異マウス作製法として、妊娠が確定した雌マウスの卵管膨大部にCRISPR-Cas9の溶液を注入し、エレクトロポレーションによって受精卵のゲノムに変異を与える方法（GONAD法）を確立した。これまでこの方法で２０系統以上の変異マウス作製ができている。本研究ではPtch1のC末端のXIAPの結合部位欠損マウス（Ptch1-dIBS）、Ptch1のC末端への2xHAタグ挿入マウス（Ptch1-2xHA）の作製に成功した。これらのマウスを用いた表現系を解析中である。
また、Ptch1-Cのプロテオミックス解析から細胞死調節に関わる分子も単離同定できた。

Strategy for Future Research Activity

変異マウス作製法として、妊娠が確定した雌マウスの卵管膨大部にCRISPR-Cas9の溶液を注入し、エレクトロポレーションによって受精卵のゲノムに変異を与える方法（GONAD法）を確立した。これまでこの方法で３５系統以上の変異マウス作製ができている。本研究ではPtch1のC末端のXIAPの結合部位欠損マウス（Ptch1-dIBS）、Ptch1のC末端への2xHAタグ挿入マウス（Ptch1-2xHA）の作製に成功したが、Ptch1-dIBSのホモ変異体マウスは半年以上月齢が経つが表現型は現れていない。さらに飼育することによって表現型が現れるかどうかを観察していく。
HA抗体を用いてPtch1-2xHAの胚の神経管、あるいは脳組織での免疫染色を行い、Ptch1の発現の詳細を観察する。特に、繊毛での局在を確認する。また、HA抗体による免疫沈降、プロテオーム解析により個体中からの新規分子の単離・同定を試みる。

Causes of Carryover

当初の計画よりも順調に研究が進み使用額が予定より減少した。今後、解析により予定通り使用が見込めると思われる。

Research Products

• [Journal Article] i-GONAD (improved genome-editing via oviductal nucleic acids delivery), a convenient in vivo tool to produce genome-edited rats (2018)
  • Author(s): Takabayashi Shuji、Aoshima Takuya、Kabashima Katsuya、Aoto Kazushi、Ohtsuka Masato、Sato Masahiro
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 8 Pages: 12059
  • DOI: 10.1038/s41598-018-30137-x
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] De novo variants in RHOBTB2, an atypical Rho GTPase gene, cause epileptic encephalopathy (2018)
  • Author(s): Belal Hazrat、Nakashima Mitsuko、Matsumoto Hiroshi、Yokochi Kenji、Taniguchi-Ikeda Mariko、Aoto Kazushi、Amin Mohammed Badrul、Maruyama Azusa、Nagase Hiroaki、Mizuguchi Takeshi、Miyatake Satoko、Miyake Noriko、Iijima Kazumoto、Nonoyama Shigeaki、Matsumoto Naomichi、Saitsu Hirotomo
  • Journal Title: Human Mutation Volume: 39 Pages: 1070～1075
  • DOI: 10.1002/humu.23550
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] De novo hotspot variants in CYFIP2 cause early-onset epileptic encephalopathy. (2018)
  • Author(s): Nakashima M, Kato M, Aoto K, Shiina M, Belal H, Mukaida S, Kumada S, Sato A, Zerem A, Lerman-Sagie T, Lev D, Leong HY, Tsurusaki Y, Mizuguchi T, Miyatake S, Miyake N, Ogata K, Saitsu H, Matsumoto N.
  • Journal Title: Ann Neurol. Volume: 83 Pages: 794-806
  • DOI: 10.1002/ana.25208.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Biallelic Variants in CNPY3, Encoding an Endoplasmic Reticulum Chaperone, Cause Early-Onset Epileptic Encephalopathy. (2018)
  • Author(s): Mutoh H, Kato M, Akita T, Shibata T, Wakamoto H, Ikeda H, Kitaura H, Aoto K, Nakashima M, Wang T, Ohba C, Miyatake S, Miyake N, Kakita A, Miyake K, Fukuda A, Matsumoto N, Saitsu H.
  • Journal Title: Am J Hum Genet. Volume: 102 Pages: 321-329
  • DOI: 10.1016/j.ajhg.2018.01.004.
  • Peer Reviewed / Open Access