2017 Fiscal Year Research-status Report
In vivo analysis of immune response by a newly developed 4-color immunohistological staining method: Rejection or tolerance following rat liver transplantation
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17K08518
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| Research Institution | Dokkyo Medical University |
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Principal Investigator |
松野 健二郎 獨協医科大学, 医学部, 特任教授 (20094047)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
上田 祐司 獨協医科大学, 医学部, 准教授 (10364556)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ラット肝移植 / 拒絶反応モデル / 免疫寛容モデル / 3重免疫酵素染色 / 4重免疫蛍光染色 / 樹状細胞 / 免疫組織学 / ドナー特異的抗体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
交付申請書では、ラットの異系肝移植において肝移植後の拒絶反応優位のモデルと免疫寛容優位のモデルを作製し、諸臓器の新鮮凍結切片のBrdUによる3重免疫酵素染色と、EdUによる4重免疫蛍光染色による細胞亜群と増殖指標の免疫組織学的解析をおこなう。これにより、ドナーおよびレシピエントのリンパ球や樹状細胞（DC）の亜群の動態を明らかにし、免疫寛容のメカニズムを考察することを目的としている。これに関して初年度(H29)の実績は、
(1) 3重免疫酵素染色により両モデルの脾臓やリンパ節を比較解析した。拒絶モデルでは、ドナー肝由来のDC亜群がレシピエントの全身のリンパ臓器に血行性またはリンパ行性に遊走し、キラーT細胞の増殖性応答を起こす事を、われわれは以前報告している(Hepatology 47:1352,2008, 56:1532,2012)。一方、寛容誘導処置として知られる移植前のドナー末梢血輸血処置(DST)を行うと、DC亜群の遊走とキラーT細胞の増殖性応答が共に有意に抑制された(追加実験中)。
(2) そこでDST処置のみを行ったレシピエントを調べると、ドナー特異的な細胞障害性抗体 (抗ドナーI型MHC抗体)が脾臓やリンパ節で産生され、移植免疫応答を抑制する制御性T細胞も誘導されることがわかった（論文発表1）。
(3) これらにより、DST後の寛容メカニズムとして、抗体によるドナーDCの除去と制御性T細胞の増加が拒絶反応を抑制することが強く示唆された(追加実験中)。
(4) 次年度予定分の寛容モデルとレシピエントにGFPラットを用いた拒絶モデルをそれぞれ作製し、移植3日目に EdU投与後臓器標本を凍結保存した(n=3)。
(5) ラット腸移植の系で4重免疫蛍光染色を試み、ドナー腸のDCがレシピエントの増殖するT細胞とクラスターを形成することを明らかにした（論文発表2）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
(1) 3重酵素免疫染色による網羅的解析については肝移植後の拒絶反応優位のモデルと免疫寛容優位のモデルで行い、後者においてDC亜群の遊走とキラーT細胞の増殖性応答が有意に抑制されることを明らかに出来た。
(2) EdUによる4重免疫蛍光染色による細胞と増殖指標の解析については、ラット腸移植の系で染色を試み明快な結果を得ることが出来た（論文発表2）。また、次年度の本染色用にレシピエントにGFPラットを用いた拒絶モデルとLewisラットを用いた寛容モデルをそれぞれ作製できた。
(3) 免疫寛容の免疫組織学的解析については、寛容処置であるDSTのみを行ったレシピエントを調べ、ドナー特異的抗体 (抗ドナーI型MHC抗体)が脾臓やリンパ節で誘導されており、この抗体が静脈投与したドナー細胞を除去できることを明らかにした（論文発表1）。
以上から、今年度の実績は交付申請書の実施計画をほぼ満たしており、進捗状況はおおむね順調に進展していると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1) H30年度には、まずDST後肝移植の寛容モデルで抗ドナーI型MHC抗体によるレシピエント免疫臓器の免疫応答抑制と移植肝の拒絶遅延の病態を解析する。これにより、DSTでは抗体によるドナーDCの除去が拒絶反応を有意に抑制することを証明する。ここで、I型MHC抗原は肝細胞にも発現しており、ドナー特異的(I型MHC)抗体が肝障害性を持つことを予備実験で確認した。そこで、主にドナーDCに発現し肝細胞には発現しないドナーⅡ型MHCに対する抗体を投与して、肝障害なしに拒絶抑制が出来るかどうかを検索する。そして、移植肝内の残存ドナーDCのフェノタイプとクラスター形成を4重免疫蛍光染色で解析し、拒絶群と比較・考察する。以上のデータから必要分を抽出し、抗体による免疫寛容誘導の論文としてH30年度中にまとめ、投稿する。
(2) 抗体を脾臓のみならず全身のリンパ節で作らせる免疫法はこれまでに報告が無い。今回新たに見つかった、DST処置のみで全身性ドナー特異的抗体応答が起こることは新型ワクチンの開発にもつながり、本研究の重要な副産物となるので、そのメカニズムの解析も並行して進めたい。すでにデータも揃ってきているので、H30年度中に仕上げ、投稿する。
(3) H31年度には,(1)と(2)が受理されるまで追加実験と論文revisionを行う。可能なら、本課題について英文総説の執筆を行う。
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| Causes of Carryover |
物品費・旅費・その他の実支出額が本年度では交付決定額より25％節約できたが、これは本年度の研究が順調に進行し、目的達成のためのデータが容易に得られたことによる。来年度は4重蛍光免疫染色の本格作業をおこなうことでパート技術員の研究補助が必要なため、次年度使用額を中心にしてパート雇用の謝金に充てる予定である。
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Research Products
(2 results)
